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锌指核酸酶技术在动物转基因中应用 　　摘要：锌指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）具有特异性识别并敲除ＤＮＡ片段中特定基因的特点，通过对ＤＮＡ片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞，是能够应用于动物转基因上的一种新技术。该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果，相对于传统的转基因技术，该技术在简化操作程序、缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高。就常用的动物转基因方法、锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述。 　　关键词：锌指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）；动物转基因；靶向修饰 　　中图分类号：Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）19－4177-04 　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ 　　ＷＡＮＧ Ｌｉｕ－ｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｊｉ－ｔｉａｎ，ＹＵ Ｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｂｉｎｇ 　　（Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ） 　　动物的转基因技术是建立在分子生物学基础上，利用基因工程等试验方法将外源基因导入动物的受体细胞，并通过受体细胞的分裂与繁殖，将整合在受体细胞基因组中的目的基因有效遗传给后代个体，并得到预期结果的一种方法。该技术始于２０世纪８０年代，１９８０年Ｇｏｒｄｏｎ等［１］通过核显微注射技术在小鼠体内的试验，成功获得了第一个转基因动物。后来一些研究人员又利用该方法陆续在兔、绵羊、猪的转基因上获得成功，在此基础上人们通过不断试验探索出其他的转基因技术，并且也在一些动物的转基因上获得成功。如逆转录病毒载体法、精子载体法、胚胎干细胞介导法等分别在牛、鸡、小鼠等动物的转基因上获得成功。但是，随着分子生物学的不断发展，研究人员对转基因结果的要求也越来越高，而这些传统的技术在一定程度上已不能满足人们的要求。为了得到更好、更符合人们意愿的试验结果，研究人员不断地探索着更为先进的转基因技术，锌指核酸酶（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）技术就是一种新的转基因技术，由于其具有独特的剪切功能而引起了研究人员的极大兴趣。１９８６年Ｄｉａｋｕｎ等［２］首先在真核生物转录因子家族的ＤＮＡ结合区域发现了Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２锌指模块，到１９９６年Ｋｉｍ等［３］人工合成了第一个ＺＦＮ，再到Ｕｒｎｏｖ等［４］发现的由４个锌指连接而成的ＺＦＮ可识别２４ ｂｐ的特异性序列，ＺＦＮ在转基因中的作用逐渐受到了研究人员的关注。 　　１ 动物转基因技术的常用方法 　　１．１ 逆转录病毒载体法 　　逆转录病毒载体法是利用病毒作为载体，将外源基因片段插入病毒载体的长末端重复序列的下游并通过其侵染作用将目的片段整合到宿主细胞的基因组中。该方法主要应用于转基因鸡和牛的生产。１９７４年Ｊａｎｅｎｉｓｃｈ等［５］发现注入小鼠囊胚腔中的ＳＶ４０ＤＮＡ能够在其体内发生整合。但真正用于转基因动物的则是Ｓａｌｔｅｒ等［６］研究人员，他们在１９８７年利用该方法生产出了转基因鸡；而Ｂｉｅｒｙ等［７］则在１９９５年以劳式肉瘤病毒（ＲＳＶ）为载体，通过将目的基因片段导入牛的胚胎，获得了转基因牛。此方法操作简便，整合效率高且整合的外源基因多为单拷贝，所以非常有利于对基因结构、功能及表达调控的研究［８］。 　　１．２ 精子载体法 　　精子载体法是通过将外源ＤＮＡ与精子混合培养后，利用带有外源ＤＮＡ的精子与卵细胞结合形成受精卵，然后将该受精卵通过胚胎移植转移到动物的子宫内，经过发育后形成转基因动物［９］。１９８９年Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等［１０］利用该方法生产出了转基因小鼠，并发现转基因小鼠体内的外源ＤＮＡ能够遗传给后代。他们的这一结果引起了其他研究人员的关注。该方法虽然操作简便，但其整合率低，需要通过改进来提高成功率。Ｓｑｕｉｒｅｓ等［１１］在该方法的基础上利用脂质体包埋外源ＤＮＡ的方法成功地获得了转基因鸡；Ａｎｔｈｏｎｙ等［１２］首先将精子的细胞膜破坏掉后再与外源ＤＮＡ混合培养，然后将带有外源ＤＮＡ的精子注入小鼠处于减数分裂中期的卵母细胞内，提高了转基因小鼠的数量。 　　１．３ 胚胎干细胞法 　　胚胎干细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＥＳ细胞）来源于早期的胚胎细胞，由于其具有高度未分化的特性，随着生命体的发育它可以分化为多种细胞类型［１３］。该方法主要是在体外通过同源重组的方法将外源ＤＮＡ片段整合到ＥＳ细胞的基因组中，然后再将ＥＳ细胞转移到动物的囊胚中，通过在动物