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苹果栽培品种SSR指纹图谱构建 　　摘要：【目的】通过构建苹果栽培品种的SSR标记指纹图谱数据库，以实现对苹果品种的快速、准确鉴定。【方法】以国内外40个主要栽培品种为试验材料，选用均匀分布于17条染色体上的144对SSR引物进行PCR扩增并采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与SSR荧光标记毛细管电泳相结合的方法进行检测。【结果】结果表明，从144对SSR引物中筛选出了35对多态性较高、谱带清晰的引物，35对引物共检测到314个等位基因，每对SSR引物扩增出等位基因数3～15个，平均8.97个；多态性信息含量指数（PIC）变化为0.455 3～0.834 6，平均为0.692 0；各个位点的杂合度在0.475 0～1.000 0，平均为0.794 3；标记系数（MI）平均为6.208 0，其中CH04c10引物对苹果基因组DNA变异检测最有效，其多态性信息含量指数和标记指数均最高，分别为0.834 6和12.519 0。 以CH03d07、NZ02b1和CH05c04这3对引物进行组合鉴定，即可将40个苹果品种完全区分开。与6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，荧光标记毛细管电泳检测能更准确读出目标片段的大小，检测效果更为理想，更适合于DNA指纹图谱数据库的建立。【结论】将2种检测方法结合构建苹果品种DNA指纹图谱，结果更准确、更可靠。 　　关键词：苹果； SSR标记； 荧光标记； 指纹图谱 　　中图分类号：Ｓ６６1．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－971－０7 　　DNA指纹图谱具有多位点性、高变异性和简单稳定的遗传性，因而自其诞生就引起了人们的重视，表现出巨大的实用价值[1]。国内外对于利用DNA指纹图谱数据库进行品种鉴定极为重视。英国、德国、荷兰、法国、西班牙等五国于1997年启动了一项利用简单重复序列（SSR）标记技术进行小麦、西红柿等主要作物品种鉴定的项目，制定了统一的利用分子标记技术进行品种鉴定的方法标准[2]。北京农林科学院玉米研究中心已建成了基于SSR标记技术的玉米指纹图谱数据库[3]，包含的玉米品种数量已达5 000余份。国际植物新品种保护联盟（UPOV）已将SSR标记技术和单核苷酸多态性技术（SNP）推荐为适合构建指纹图谱数据库的2种技术，认为SSR标记技术是目前最为成熟的技术[4]。 　　目前建立作物的SSR指纹图谱的方法多采用琼脂糖、普通聚丙烯酰胺凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、TP-M13-SSR技术[5-6]和常规荧光SSR技术。从分辨率上看，非变性聚丙烯酰胺凝胶均不能分辨大小在2个碱基对以内的差异，琼脂糖凝胶分辨率更低；而变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合放射自显影、银染等手段能够分辨最小为1个碱基对的差异，能够分辨同一SSR位点上的不同等位基因，完全满足构建指纹图谱数据库对等位基因大小分辨率的要求。基于DNA测序仪的SSR荧光标记毛细管电泳检测方法可以得到定量的DNA片段分析数据，与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，毛细管电泳检测结果更为精确、灵敏、高效，更适用于大批量品种的检测分析[7]。因此利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测与SSR荧光标记毛细管电泳检测方法相结合的方法进行苹果品种DNA指纹鉴定，方法可行、结果可靠[8]。 　　苹果属种质资源丰富、种类多、分布广，且利用历史悠久，在果树栽培、生产和育种上经济价值很高[9-10]。随着果树育种技术的不断发展，新培育出的苹果栽培品种越来越多，保证品种的真实性、维护生产者与育种家的权益显得日趋重要。而苹果多用无性繁殖，树体基因型高度杂合，极易造成同物异名或同名异物现象，鉴别起来较困难。以往对品种鉴别主要靠形态指标，但对于差异并不明显的个体，传统的形态特征很难识别，而利用SSR分子标记对品种进行鉴定和分类[11-12]，是一种简单准确而且可靠的方法。因此构建苹果SSR指纹图谱数据库对苹果品种鉴别具有重要意义。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.2 方法 　　1.2.5 电泳数据分析 使用Genemapper4.0软件收集原始数据，再利用Power Marker V3.25对供试材料进行分析。最后将2种方法获得的等位基因数据进行统计，对比与分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 PCR扩增体系与引物退火温度 　　2.2 核心引物的筛选及SSR多态性 　　选用均匀分布在苹果17条染色体上的144对SSR引物，利用8份苹果材料进行PCR扩增及电泳检测，并对PCR扩增体系与引物退火温度进行优化，筛选出35对多态性高、谱带清晰的引物。然后利用这35对引物对40份材料扩增，分别进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测与SSR荧光标记毛细管电泳检测，对数据进行统计分析后得到40份材料在35个位点的数据（表3）35对引物共检测到3