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玉米丝轴黑粉菌原生质体制备与再生条件研究 　　摘要：以玉米丝轴黑粉菌（Sporisorium reilianum f.）为供试菌株，对其孢子原生质体的制备和再生条件进行研究。结果表明，交配型菌株SR1加入5 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzymes）、50 mg/mL崩溃酶（Driselase）与50 mg/mL蜗牛酶（Snailase）混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min摇床上酶解10 min，原生质体得率为99.36%、产量1.35×108个/mL，以山梨醇为稳渗剂，原生质体涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培养基上，再生率可达35.63%。 　　关键词：玉米丝轴黑粉菌；原生质体；制备；再生 　　中图分类号：S435.131.42 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4520-04 　　玉米丝黑穗病是由玉米丝轴黑粉菌（Sporisorium reilianum f. ）引起的严重威胁玉米产量的病害。20世纪90年代前在中国发生较重，以后由于抗病品种的推广有所减轻。近年来，由于新品种的引进和抗性鉴定工作的滞后，玉米丝黑穗病又逐年加重，每年因玉米丝黑穗病危害减产达30万t[1]。玉米丝轴黑粉菌在玉米发芽期侵染，花期观察到明显症状，雌雄穗产生充满孢子堆的病瘿，表现为典型的苗期侵染、花期发病特点。一旦发病，往往整株都没有收成。虽然该病在苗期也有些症状，如植株矮小、茎基膨大如笋状、叶片簇生等，但是症状不明显，且不容易与其他病毒病、生理病害、根部虫伤等所致症状相区分，因此难以在苗期发现病情，给该病的早期防治带来一定难度。有学者研究苗期玉米丝黑穗病的检测技术，进行了质壁分离法PCR检测技术鉴定[2]以及利用苗期检测可溶性糖含量鉴定[3]等，这些方法有一定的局限性，难以应用于实际生产。人们选育较好的抗性品种用于玉米丝黑穗病防治，研究者在玉米抗玉米丝黑穗病育种方面的研究较多，如抗性机理、抗性遗传、抗病基因定位和抗病种质资源[4]等。从分子水平研究玉米丝轴黑粉菌的致病机制，有助于从根本上控制该病的危害。目前对玉米丝黑穗病菌的遗传转化国内外鲜有研究报道。试验通过制备该菌的原生质体，发展出有效的遗传转化体系，为研究玉米丝黑穗病菌的致病机制提供基础。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 原生质体的制备和影响因素测定 玉米丝轴黑粉菌菌种接入PDA培养基中培???3 d，取1/20接种量转至新的PDA培养基继续培养24 h，离心收集菌体，无菌水洗涤1次，加入酶液（表1）后，置摇床上28 ℃ 100 r/ min酶解。每隔 5 min取样镜检观察，待视野中绝大多数孢子释放原生质体时停止酶解，2 000 r/ min离心 6 min后用STC缓冲液洗涤3次，离心收集原生质体。 　　1）不同酶及组合对原生质体制备的影响。以不同浓度的溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶单独处理或者混合处理玉米丝轴黑粉菌的担孢子，比较单一酶和混合酶对原生质体释放的影响。 　　2）不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响。用CPB配制不同浓度的NaCl、MgCl2、KCl、D-sorbitol、蔗糖5种渗透压稳定剂，比较不同渗透压稳定剂及不同浓度对原生质体制备的影响，确定最佳渗透压稳定剂[6]。 　　3）菌龄对原生质体制备的影响。将活化3 d后的玉米丝轴黑粉菌菌液以1/20的接种量扩大培养，收集不同时间段的担孢子以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶和50 mg/mL蜗牛酶3种酶混合酶解，比较菌龄对原生质体制备的影响。 　　4）酶解时间对原生质体制备的影响。在酶解5、10、15、20、25 min时观察原生质体的形成及数量。 　　5）酶解温度对原生质体制备的影响。比较25、28、30、35、37 ℃ 5个酶解温度对原生质体制备的影响。 　　1.2.2 不同酶组合及酶解时间对原生质体再生的影响 将不同酶浓度组合及不同酶解时间制备的原生质体用平板稀释法涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培养基上，5～7 d后观察菌落数量并计算再生率。 　　2.1 影响原生质体制备的因素 　　2.1.1 不同酶及其组合对原生质体制备的影响 试验结果见表2。酶的种类对原生质体释放影响很大，当用溶壁酶单独处理玉米丝轴黑粉菌担孢子时，原生质体得率很低。即使延长酶解时间至180 min，原生质体得率也仅为5.33%。 　　两种酶液混合处理的原生质体得率虽然有所提高，但是提高不多，原生质体得率为10%左右。用5 mg/mL溶壁酶、20 mg/mL崩溃酶和20 mg/mL蜗牛酶3种酶混合处理丝轴黑粉菌60 min时，原生质体得率为57.06%，与单一酶和两种酶处理相比显著提高。5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶、50 mg/mL蜗牛酶3种酶的混合液为