微生物实验大论文土壤中菌的分离、纯化和鉴定.docxVIP

土壤中X菌的分离、纯化和鉴定金乾昂 3110100290 动物科学学院摘要：自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态从混杂的微生物群体中获得只含有某一中或一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。同时本实验通过鉴定分离纯化得到的X菌，了解该X菌的菌落形态特征、个体形态特征以及个体生理生化特征。进而更好地掌握微生物的分离纯化方法和无菌操作技术，以及微生物的鉴定技术。关键字：土壤微生物分离纯化鉴定生理生化特征一、实验材料1、分离材料：样品：新鲜土壤。培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）。无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水浴锅。试剂：5000U/mL链霉素液 0.5％重铬酸钾液2、纯化材料培养基：灭菌的牛肉蛋白胨琼脂培养基，淀粉琼脂培养基，马铃薯蔗糖的斜面其他：接种环，酒精灯。3、鉴定材料菌种：大肠杆菌（Escherichia ccoli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）。培养基：淀粉培养基、油脂培养基、石蕊牛乳培养基。试剂：碘液。其它：试管、三角瓶、移液管、接种针、接种环、培养皿。二、实验步骤1、培养基的配制与灭菌—（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基）称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。无菌水制备：100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。常用器皿的准备：清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等，捆好后进行加压蒸汽灭菌2、分离步骤：制备土壤稀释液： 45mL无菌水 9mL无菌水 9mL无菌水 9mL无菌水 10-1 10-2 10-3 10-4牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（划线法）（涂平板）马铃薯蔗糖培养基马铃薯蔗糖培养基 +链霉素（混菌）+链霉素（混菌）淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基+KCrO4(划线)（涂平板）3、纯化步骤1）观察以上培养基培养所得的菌落的形态特征，并对混菌和涂平板的的培养基菌落计数。2）挑取上述三种培养基的单菌落，采用斜面接种法分别接种于3种不同的培养基斜面试管中，塞上棉塞，做好标签进行培养。4、鉴定步骤：1）淀粉水解试验在淀粉培养基上接种枯草杆菌B2，大肠杆菌B19，和每组分离的菌种；每种菌种涂片0.3~0.5cm大小的圆；倒置于370C恒温箱中培养24h，观察时打开皿盖，滴加少量碘液于平板上，使其铺满整个平板。（如右图所示）2）硫化氢试验用新鲜斜面培养物（金黄色葡萄球菌Sa,大肠杆菌B19，和每人分离获得的细菌菌株）分别接种到硫化氢试验培养基中，接种后用无菌镊子夹取醋酸铅滤纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接进培养基表面，不接触液面，适温培养。3）石蕊牛奶试验分别接种枯草杆菌B2,大肠杆菌B19，和每人分离获得的细菌菌株于石蕊牛奶培养基中，置于370C恒温箱内培养7d。另外保留1支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照5、革兰氏染色观察细菌涂片（在同一张载玻片上涂以大肠杆菌；自己的细菌；金色葡萄球菌）→初染（结晶紫1min）→媒染（碘液1min）→脱色（95％酒精脱色30s）→复染（番红染色液1min）→油镜观察三、实验结果1、X菌菌落的形态特征图1土壤菌落培养经过培养的6个培养基部分有杂菌污染。由涂片可以看到牛肉胨培养基中有少量被真菌污染，高氏培养基涂板上放线菌的长势较好，马铃薯种培养的真菌有被细菌少量污染。这些都可能由于实验操作过程中的不规范以及空气中微生物的污染。经过对培养基上菌落的计数统计得：表1、培养基菌落数目统计培养基名称（稀释）对应菌种类培养基中菌落数对应5g土壤中菌数高氏一号（10-2）放线菌5161.29×106牛肉胨（