微量元素对红树林内生真菌增殖生长及次级代谢的影响课件.pptVIP

微量元素对红树林内生真菌1403#增殖生长及次级代谢的影响——HPLC/ESI/MS研究分析;红树林（Mangrove）微生物;海洋天然产物研究室红树林研究成果;红树内生真菌1403#代谢产物研究情况;; 菌1403#分离得到的蒽醌和萘醌类化合物对人宫颈癌细胞、人肝癌细胞、人喉癌细胞、大肠癌细胞有显著抗癌活性，其IC50值均低于10μg/ml 。 前期研究发现微量元素对菌体生长代谢影响显著。;微量元素营养物对微生物生长影响 ;二、实验目的及创新点;优化真菌1403#培养条件，提高次级代谢的种类和含量。 研究微量元素对真菌1403#生长和次级代谢的影响。 运用HPLC-ESI-MS手段对代谢产物进行定性、定量分析，从中发现新的代谢产物。 ;蒽醌、萘醌类化合物有很好的抗肿瘤活性，改变培养条件可能发现结构新颖、具有药理活性的新化合物； 国内运用LC-MS方法研究海洋微生物的代谢产物文献报道并不多见，但实验证明，此方法是种可行而且可靠的研究手段，不但能提供丰富的数据信息，而且对微生物规模培养及分离提纯等后续研究工作有很强的指导意义。;三、实验部分;（一）微量元素条件下真菌1403#发酵培养跟踪; ;;酒石酸、Fe;Cu、Mo;Zn、Co;Cd、Ni;空白对照;结果与讨论;含有硼酸、Mn2+、Fe3+的培养基对促进次级代谢物的产生作用显著；含有Cu2+、酒石酸、Mo2+、Zn2+、Co2+的培养基对次级代谢有拮抗作用。 含有硼酸对次级代谢也有显著的刺激。发酵液颜色变得最深，代谢最旺盛。 Cu2+对次级代谢过程有很大的改变，菌体由始至终都没有明显的红色次级代谢物产生。;菌体干重;（二）HPLC定量分析真菌1403#5种次级代谢物含量;标准对照样品 ;色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5μm，3.9×150mm；流动相:V(甲醇):V(1%冰醋酸溶液)=45:55；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测波长254nm/280nm；进样量15μL。;标准对照峰判定 精密称取对照样纯品适量，甲醇定容，按上述色谱条件分别进样，记录各物质保留时间；再吸取混合对照样品储备液，进样15μL。对照各图谱保留时间，判定化合物归属。 ;表4;标准曲线绘制 化合物(1)：Y=2.31495+0.0000271774*X R=0.99802 化合物(2)：Y=4.30504+0.000173795*X R=0.95762 化合物(3)：Y=-1.24957+0.000468294*X R=0.99364 化合物(6)：Y=2.57425+0.0000330772*X R=0.99865 化合物(11)：Y=1.59166+0.0000176694*X R=0.99901;不同培养条件下4种化合物代谢浓度示意图;硼酸（样A）培养基中能明显刺激化合物(1)(2)(3)的代谢； Fe3+离子（样D）对化合物(3)代谢的促进明显。 Mn2+、酒石酸、Cu2+、Mo2+、Zn2+、Co2+（样B、C、E~I）对4种对照化合物的次级代谢有明显的抑制作用。 HPLC实验还发现，所有培养条件所得样品均没有出现化合物(11)信号。 HPLC测试显示，Cu2+培养条件下所得谱图峰形比较丰富，有些峰还为新的未知峰。;（三） HPLC分析3种条件下1403#真菌的代谢物;;色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5μm，3.9×150mm；流动相为甲醇、乙腈和0.4%冰醋酸水溶液（pH=3.2）三元梯度洗脱，梯地洗脱见表7；柱温为室温；流速1.0ml/min；检测波长254nm/280nm；进样量15μL。;结果与讨论;5.2、空白对照样品(M)HPLC谱图;表8 样品主要峰保留时间（min）及物质归属判断;5.3、样(A)HPLC谱图对照;5.4、样(D)HPLC谱图对照;5.5、样(E)HPLC谱图对照;（四）两种1403#发酵萃取物HPLC-ESI-MS分析;HPLC-ESI-MS分析 色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18柱 5μm，3.9×150mm；流动相为甲醇、乙腈和0.4%冰醋酸水溶液（pH=3.2）三元梯度洗脱，梯地洗脱见表9；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测波长254nm；进样量15μL。 ;标准对照样品;结果与讨论 ;色谱图保留时间为31.94、33.24、34.96min（图7）所得峰形尖锐清晰，但在NI-ESI、PI-ESI中均没有找到对应质荷峰。作者对照前面实验所得HPLC图谱（图3、5）各峰相对位置及强度，推测这3个峰分别为化合物(6)(11)(1)。研究该3种化合物结构，猜测可能是它们均含有多个甲氧基-OCH3和甲基-CH3，而没有相应活