蛋白质组和蛋白质学.ppt

从基因组学到蛋白质组学  人类迈入后基因组时代 基因 蛋白质组 protein + genome proteome 一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质 在整体水平上研究细胞内全部蛋白质的组成、结构及其代谢规律； 蛋白质的种类、水平、修饰和构象的变化总是处于一个新陈代谢的动态过程中。 研究细胞内与某个功能有关或在某种条件下的一组蛋白质。 一、 分 离 纯 化 一、分 离 纯 化 目的蛋白质的含量 提取蛋白质的材料 一、分 离 纯 化 机械法 物理法 化学法 根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行： 1.根据溶解度 2.根据分子量 透析和超滤 平衡离心 凝胶过滤层析 3.根据电荷 毛细管电泳 离子交换层析 4.根据蛋白质的亲和能力 亲和层析 （四） 蛋白质分离纯化的条件 缓冲液 盐、金属离子和螯合剂 还原剂 去垢剂 蛋白酶抑制剂 表面效应 蛋白质的环境因素 温度 储存 二、分析鉴定 二、分析鉴定 （一）Western印迹技术 基本操作步骤： 蛋白样品的制备 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电转移 蛋白质与抗体的结合反应 目标蛋白质的显示 （二）二维凝胶电泳（2-DE)技术 目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一 由两相组成： 第一相：等电聚焦凝胶电泳 (根据蛋白质电荷差异) 第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 (根据蛋白质分子量差异) 2-DE分析的基本步骤 2-DE获得的蛋白质图谱 通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。 2-DE图像分析软件包操作过程： （四）放射性核素标记亲和标签法 （五）蛋白质芯片技术 原理 样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（m/e）的差异确定分子量。 应用 蛋白质的序列分析 研究蛋白质的修饰 （七） 其它方法 Edman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序 核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构 X射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等 分子物理特性鉴定：（分子大小、性质、序列组成及结构等） 相对分子量大小：质谱 序列测定：N/C端测序，毛细管电泳测序 结构鉴定：光谱、X衍射和生物信息计算预测 2.2.2 蛋白质序列鉴定——测序技术 串联质谱测序技术 N端测序法： Edman降解法、丹磺酰氯法， 二硝基苯氟法、毛细管电泳技术） C端测序法：异硫氰酸法（利用C端羧基水解（羧基肽酶）来进行测序 ，但由于C端羧基化学性质不活泼，导致效率很低（ 6-8个残基） 原理：使用异硫氰酸苯酯（PTC)与肽肽链氨基酸反应产生PTC-肽，在强酸作用下，末端aa掉下来，形成环化PTC-aa。而失去一个aa的肽又可以再次与PTC反应，这样循环测序。 苯乙内酰硫氨基酸（PTH-aa ） 环化 苯氨基硫甲酰肽（PTC-肽） 强酸 异硫氰酸苯酯 （PTC） 肽链 失去原N-端 毛细管电泳技术：蛋白质微量N端顺序测定。 原理：是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析。 特点：灵敏度比HPLC高两个数量级。样品需量少（10fmol）的水平检测氨基酸。 丹磺酰氯法:强荧光剂，能专一结合肽链α-氨基生成丹磺酰-肽，随后水解生成丹磺酰-氨基酸 ，然后电泳可鉴定N端氨基酸。 二硝基苯氟法： 阳离子 阴离子 中性离子 质谱仪 毛细管电泳仪 Edman 降解测序仪 C端测序仪 问题解决： 新的偶联和裂解试剂； HPLC（液相色谱） 2.2.3 蛋白质结构分