2018年基因工程基本操作程序.pptVIP

第四步：目的基因的检测与鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 1、导入检测 目的： 方法： DNA分子杂交 从转基因生物中提取的基因组DNA 探针？ 杂交的对象？ 用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段 ——检查是否成功 ① 目的基因的获取 ② 基因表达载体的构建（核心） ③ 将目的基因导入受体细胞 ④ 目的基因的检测与鉴定 第一步：目的基因的获取 1、目的基因主要是指 ____________________也可以是一些具有调控作用的因子。 编码蛋白质的结构基因 3、常用方法： 人工合成法 反转录法 化学合成法 利用PCR技术扩增 从基因文库中获取 2、获得途径： 从自然界已有物种中分离 人工方法合成 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如:cDNA文库） 基因文库？ (1) 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因 基因组文库的构建模式图 cDNA文库的构建模式图 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA 反转录酶 双链DNA (cDNA) 某种生物的mRNA 某种酶 DNA聚合酶 与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNA文库 基因组文库与cDNA文库的比较P10表 文库类型 基因组文库 cDNA文库 大小 基因中是否有启动子 基因中是否有内含子 基因多少 物种间的基因交流 小 大 有 无 有 无 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 部分基因可以 可以 1、怎样从基因文库获得所需要的目的基因？ 2、P9寻根问底 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2、原理： DNA复制 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四种脱氧核苷酸(dNTP) 一对引物： 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) 4、条件： 一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 已知目的基因的核苷酸序列 3、前提： 温度控制 PCR扩增仪 5、方式： 指数 2n 6、结果： 使目的基因的片段在短时间内大量地扩增 以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数） 扩增过程 a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 DNA复制 PCR技术 不 同 点 解旋方式 场所 酶 温度条件 合成对象 联系 PCR技术与DNA复制的比较 解旋酶催化 高温变性解旋 细胞内 主要在细胞核内 细胞外 主要在PCR扩增仪内 解旋酶、普通的DNA聚合酶等 耐热的DNA聚合酶（Taq酶） 细胞内温和条件 需控制温度， 在较高温度下进行 DNA分子 DNA片段或基因 模板、原料、酶、引物、能量等均相同 你打算扩增下图所示的两端序列之间的DNA， 请写出的合适的引物。 ?? 5′-GACCTGTGGAAGC--------CATACGGGATTG-3′ ?? 3′-CTGGACACCTTCG--------GTATBCCCTAAC-5′ 引物1??????????????????????????????? 引物2 5′-GACCTGTGGAAGC???????? 5′- CAATCCCGTATG （3）通过DNA合成仪用化学方法人工合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 反转录法： 目的基因的mRNA 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA 反转录酶 DNA聚合酶 双链DNA (目的基因) 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的脱氧核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 单独的DNA片段──目的基因是不能