第一章-基因工程的分子遗传学基础PPT.ppt

;*;*;*;*;(三)蛋白质合成;*;三、基因表达的调节——操纵子模型; ;*;*;二、DNA双螺旋的变性与复性 变性：指在一定条件下（高温或变性剂等）DNA双螺旋解链的过程。 解链温度：在DNA变性进行到一半时的温度。 对260nm紫外光的吸收率——光密度值（OD），可用来检测溶液中DNA单链或双链的浓度。 复性：指DNA分子由单链状态恢复到双链结构的过程，又称退火。 ;变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。;变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加;DNA变性曲线;复性过程 ①单链分子间碰撞形成局部双链 ②局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 ③局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 ④形成完整的双链分子;;第三节 分子杂交;一、原位分子杂交;膜上原位杂交： 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上，这种膜只吸附单链DNA，将影印好的膜用NaOH处理，不仅可杀死细菌，还可使DNA变性吸附在膜上，再用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附在膜上的空白处，称为预杂交（防止探针被吸附在背景上，干扰实验结果），膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。 常用于从基因文库中钓基因。 ;*;*;*;1、待测核酸样品的制备 1）裂解或破碎细胞 2）抽取纯化基因组DNA 3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 2、待测DNA样品的电泳分离 1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记;*;*;b.常用的固相支持物;2）Southern印迹的常用方法 a. 毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。;基本原理： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。;b. 电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。;c. 真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤 膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。;5、Southern杂交 1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交，缓冲液为不含DNA探针的杂交液。 2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交。 3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA。;6、杂交结果检测;（二）RNA印迹（Northern印迹杂交） 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、对待检样品中mRNA的长度和丰度进行分析 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA RNA印迹可以测定某基因表达的时空特异性。;*;（三）蛋白质印迹（Western blotting） 1、用来检测蛋白质而不是检测核酸。 2、不用毛细管原理，而是通过电场的作用将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质的技术。 ;（四）斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量;*;*;*;一、限制性核酸内切酶 DNA体外重组， 首先必须获得需要重组和能够重组的DNA片段 用限制性内切核酸酶 酶切DNA分子 是获得这种DNA片段的主要途径。;限制性内切酶－基因的剪刀;（一）限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）概念 是一类能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近 切断双链DNA磷酸二酯键的核酸水解酶。 按其性质可分为3大类。 Ⅰ型 有特定的识别顺序，但是切点与之有一定距离。 反应要求有ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。 酶由不同的α、β和γ亚基组成。 全酶