第十二章 遗传工程PPT.ppt

四、DNA的体外重组 1.体外通过限制性内切酶 　的修剪和DNA连接酶的 　连接； 2.目标DNA分子+ 载体 　DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子。 五、目的基因的分离与鉴定 ㈠、基于基因文库的基因分离方法（P267）： 1.构建基因库（library） ： 　　基因文库是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。 　　 ①. 基因组文库(genomic library) ： 　将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。 ②. cDNA文库： 　　以mRNA为模板è经逆转录酶合成cDNAè构建基因库。 基因组文库与 cDNA文库的比较： 基因组文库包含基因组的所有基因。 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列。 分离特定基因，cDNA库比较方便。 研究调控序列，必须基因组文库。 2. 从基因库中分离特定的基因： ①. DNA探针： 是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。 利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆； 制备的探针可以是双链也可以是单链，但在杂交反应中使用的是单链； 探针必须带有标记，如同位素、荧光素等 ②.筛选基因库： 将转化或转染后菌落印影在滤膜上； 用碱裂解使双链DNA变性成单链，牢固地结合在膜上； 再用变性过的目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交 放射性自显影，凡X光片上有黑点即为阳性克隆 定位找出培养皿所对应的菌落 ③. 序列测定和分析： 　　从基因库中筛选出的阳性克隆è 分析、鉴定è 得到目的基因。 一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法(dideoxynucleotide chain termination)测定核酸序列。 5’TACGCATACGACATTGCAAC3 ’ ddTATGCTGTAACGTTG5’ ddTGCGTATGCTGTAACGTTG5’ ddTGCTGTAACGTTG5’ ddTGTAACGTTG5’ 待测序的DNA模板 引物 DNA聚合酶 dNTP ddTTP Sanger双脱氧链终止法 ddTAACGTTG5’ ddTTG5’ ddTG5’ 电泳方向 ㈡、T-DNA标签分离基因（P286）： T-DNA T-DNA ㈢、基于PCR的基因克隆： 聚合酶链式反应(polymerase chainReaction，PCR)可以体外快速扩增DNA。 美国Mullis(1986)发明，是现代生物学发展史上的一个里程碑。 PCR反应三个步聚(一个循环)： 1. 变性：94~95℃使模板DNA双链变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与互补的DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，于72 ℃下合成模板DNA的互补链。 第十三章　遗传工程（P256） 第一节遗传工程概述 遗传工程（P257）： 指利用工程技术的方法改造和修饰生物体， 使其产生新的性状或产品， 从而改良生物体的一种遗传学手段。 广义遗传工程包括: 　细胞工程、酶工程、发酵工程、染色体工程、细胞器工程等。 狭义遗传工程是指: 　　基因工程(重组DNA技术)。 一、基因工程概述: 概念（P256） ： 利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组， 获得重组DNA分子然后导入宿主细胞或个体， 使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。 第二节 基因工程 20世纪70年代诞生 2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。 基因工程 在体外切割、拼接，构建重组DNA分子； 将重组DNA分子导入受体细胞或生物体； 使外源基因在受体内复制、转录、翻译，并使受体的遗传特性得到修饰或改变。 有性杂交和基因工程 通过有性杂交实现遗传重组，在获得目标性状的同时常常伴有其他不需要的性状改变。 通过基因工程只转移个别基因，只改变目标性状。 基因工程与有性杂交相比较的优越性： 跨越物种障碍 只改变个别性状 人为控制表达 步骤(P257)： 　①．从细胞和组织中分离DNA； 　②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； 　③．将酶切DNA分子与载体DNA连接,构建能在宿主 细胞内自我复制的重组DNA分子； 　④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制； 　⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体； 　⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系或个体。 二、基因工程的工具酶（P25