第八章酵母基因工程PPT.ppt

真菌基因工程;一、真菌表达系统的优缺点;二、酵母转化系统 ;1、酵母宿主系统; 用作模式真核生物的酵母宿主菌;抑制超糖基化作用的突变宿主菌;提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;人工构建质粒: 5种 酵母附加型质粒（YEp） 酵母复制型质粒（YRp） 酵母着丝粒质粒（YCp) 酵母人工染色体（YAC） 酵母整合型质粒（YIp）;酿酒酵母中的2μ环状质粒;含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体 ;YEp质粒;YRp质粒;YCp质粒;YAC质粒;YIp质粒;3 用于酵母转化子筛选的标记基因; 宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子 主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA- 载体：携带相应的合成基因 如：leu1/leu2、trp1、his3/his4 、ura3 选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基; 显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白;4 酵母菌转化方法;酵母菌原生质体转化法;碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化;酵母菌电击转化法;5 外源DNA在酵母宿主细胞中的命运;三 酵母表达系统;（一） 酿酒酵母表达系统;1、酿酒酵母启动子;1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH;2）半乳糖激酶启动子（GAL1）;2）半乳糖激酶启动子（GAL1）;3）pho4TS-PHO5启动子;酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL ;*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 *信号肽结构： ;*分泌效率高 *在酵母系统具有通用性 *88个残基组成 ;糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白???的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化 ;* 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成 O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团;1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;F 利用重组酵母生产乙肝疫苗;F 利用重组酵母生产乙肝疫苗;乙型肝炎病毒的结构与性质;乙型肝炎病毒的结构与性质;乙型肝炎病毒的结构与性质;产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母;;产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母