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棉花遗传转化过程中外植体对卡那霉素敏感性研究 　　摘要：文章研究了以下胚轴为转化的外植体材料，根癌农杆菌介导的棉花遗传转化过程中，下胚轴、胚性愈伤组织（EC）、体细胞胚胎（胚状体）三种外植体不同的生长阶段，对卡那霉素（Kan）的敏感性差异。结果表明：体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（Kan）最为敏感，下胚轴次之，胚性愈伤组织（EC）则最不敏感。 　　关键词：棉花；下胚轴；农杆菌；胚性愈伤组织（EC）；胚状体 　　中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0061-2 　　 　　0 引言 　　在对棉花进行遗传转化之前，最重要的就是先要针对所选用的外植体材料不同，来选定一个合适的抗生素（一般选用卡那霉素）筛选浓度，这是外源基因转化成功的一个很关键的因素。而在对被转化过的外植体进行培养时，也有必要根据外植体生长的不同阶段对抗生素的敏感性差异，适当的调节培养基中的筛选抗生素浓度，这样才能在最大限度上筛选得到再生阳性植株。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　棉花品种为“珂字棉312”，由上海交通大学农业与生物学院左开井博士提供。 　　1.2 主要培养基如下 　　G1培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+ IAA、KT、2,4-D各0.1mg/L +羧苄青霉素(Cab) 500mg/L+卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5； 　　G2培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+6-BA 0.15mg/L +KT 0.15mg/L +头孢青霉素(Cef) 500mg/L +卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5； 　　G3培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+6-BA 0.15mg/L +KT 0.15mg/L +谷氨酰胺0.5g/L+天门冬酰胺0.5g/L+头孢青霉素(Cef) 500mg/L+卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5； 　　1.3 方法 　　棉花下胚轴、胚性愈伤组织（EC）、体细胞胚胎（胚状体）获得的具体方法参照商海红（2009）和Ganesan Sunilkumar and Keerti S.Rathore（2001）。 　　1.3.1 下胚轴对卡那霉素（Kan）的敏感性 将卡那霉素（Kan）浓度设为0、10、25、50、75、100和125mg/L 7个梯度。选择生长状态相当的下胚轴切段，分别接种到含有以上7个不同Kan浓度的7种G1培养基上生长。每隔3周左右对培养基继代一次。约2个月后，分别统计各培养基上下胚轴的出愈率情况，并记录。 　　1.3.2 胚性愈伤组织（EC）对卡那霉素（Kan）的敏感性 选取一定数量的生长状况相同的胚性愈伤组织，将其分为7份，对每一份的胚性愈伤组织块进行称重，并记录。然后分别接种在卡那霉素（Kan）浓度为0、10、25、50、75、100和125mg/L的7种G2培养基上，每隔3周左右对培养基继代一次。分别在7周、10周和13周后，对每一个培养基上的胚性愈伤组织进行称重，并记录。 　　1.3.3 体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（Kan）的敏感性 选取一定数量的生长状况相同的体细胞胚胎（胚状体），将其分为7份，记录每一份的胚状体数量。然后分别接种在卡那霉素（Kan）浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50和60mg/L的10种G3培养基上，每隔3周左右对培养基继代一次。分别在6周、12周和15周后，对每一个培养基上的胚状体数量进行记录。 　　2 结果 　　2.1 下胚轴对卡那霉素（kan）的敏感性变化曲线 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 图1 棉花下胚轴对卡那霉素（Kan）的敏感性 　　Fig.1 Sensibility of explants to the concentration of Kanamycin（Kan） 　　棉花下胚轴本身对卡那霉素（Kan）就具有一定的抗性，随着卡那霉素（Kan）浓度的提高，这种抗性也逐渐降低，主要表现在下胚轴出愈率也逐渐降低（见图1）。当Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L时，二者出愈率差异很小，分别为21.8%和19.84%，当浓度大于75mg/L时出愈率急剧下降，在浓度达100mg/L和125mg/L时，出愈率仅为5.42%和2.27%。综合来看，下胚轴对卡那霉素（Kan）的浓度变化并不是十分敏感。如果以下胚轴作为遗传转化的外植体材料时，卡那霉素（Kan）的筛选浓度应选择50或75mg/L为最佳。 　　2.2 胚性愈伤组织（EC）对卡那霉素（kan）的敏感性变化曲线