gas6通过pi3kaktfoxo3a通路在预适应中起心肌细胞保护作用-gas 6 plays a role in myocardial cell protection in preconditioning through pi 3 kaktfoxo 3a pathway.docxVIP

独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华 中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于必威体育官网网址□ ，在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址□。（请在以上方框内打“√” ）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日前言缺血性心脏病是造成人类死亡的主要疾病之一，心肌血流被阻断超过 30 分钟就 会引起细胞内各超微结构的改变和功能异常，从而导致心肌细胞出现不可逆转的损伤 乃至死亡，细胞死亡主要表现有坏死和凋亡两种形式，及时恢复心肌血液供应是挽救 受损心肌的重要措施。然而，通过大量的动物实验和临床观察发现，心肌血流供应恢 复后，缺血心肌细胞的损伤反而加重，甚至会产生更大范围的损伤，如：心肌收缩功 能障碍，心律失常等，此种现象称为缺血/再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）。 心肌缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)，这一概念由 Murry 等【1】在 1986 年提 出，即通过一次或多次短暂反复的缺血再灌注，可以促使心肌增强对缺血缺氧的耐受 能力。近几年研究表明，IPC 是一种内源性保护机制，其主要通过对死亡受体途径和 线粒体途径的影响发挥抗细胞凋亡作用，但其确切的作用机制仍不清楚。Gas6（growth arrest-specific gene6）首次在缺乏血浆培养的 NIH3T3 细胞中被发现， 从结构上来讲属于维生素 K 依赖性蛋白质家族【2】。与抗凝蛋白 S 具有相似的同源性， 其 N 端是富含 γ-羧基谷氨酸基的 Gla 区（可以结合到细胞磷酸酯膜上），紧接着为 4 个表皮生长因子样重复区，C 端是两个性激素结合球蛋白区域。Gas6 能与受体酪氨酸 激酶亚家族的三个成员产生相互作用，在抗细胞凋亡、止血、免疫反应、抑制血管内 皮钙化及炎症反应等生理病理过程中起着特殊的作用【3】，例如：它能保护体外培养的 神经上皮细胞免于凋亡【39,40】。Gas6 在许多组织中都有表达，早在 1998 年，有人通过 RNA 印迹法发现了 Gas6 基因在大鼠胚胎和乳鼠心脏中的表达【4】。Axl 是一种单跨膜 蛋白质分子，其胞内部分为酪氨酸激酶域，其细胞外部分为两个免疫球蛋白域（球蛋 白）和两个纤维连接蛋白Ⅲ域（FNⅢ）。Axl 广泛表达于各种组织细胞中，Axl 在造 血系统、心肌、卵巢滤泡细胞、骨骼肌以及睾丸组织中的表达水平较高，大量的研究 证实 Gas6/Axl 能够在不同的组织和细胞中发挥抗凋亡作用【5,6】。它们包括 Axl、PI3k/Akt 和酪氨酸家族受体的磷酸化【7】及 NF-kB 磷酸化，caspase-3 活化的减少和 Bcl2 表达的 增加【8】FoxO3a 是转录调节因子 forkhead 家族中的一员，在不同的细胞类型中，它能激活促凋亡基因的表达。研究发现，白酒通过 Akt/FoxO3a/NF-kB 存活通路抵御心肌缺血再灌注损伤【9】。Gas6 在许多疾病中均可通过细胞存活途径减轻细胞凋亡，它是否也参与心肌缺血 预适应并对缺血再灌注损伤心肌发挥抗凋亡作用，目前国内外尚未有相关报道。因此， 本实验主要建立大鼠心肌细胞 H9C2 缺氧|复氧模型和预处理模型，来模拟心脏缺血再 灌注损伤模型和缺血预适应模型，通过对 Gas6 在预适应模型中 mRNA 的表达和相关 作用通路的下游磷酸化蛋白的表达，旨在探讨究 Gas6 在心肌缺血预适应中的作用及 可能的作用机制。材料和方法一、主要实验仪器与试剂1 主要试验仪器台式高速低温离心机美国 Eppendorf 公司实时荧光定量 PCR 仪BIO RADDYY-6C 电泳（转膜）仪北京六一厂WD9405A 脱色摇床北京六一厂TL-420D 水浴锅天力医疗器械有限公司CM-230 纯水仪艾科浦79-1 磁力搅拌器常州澳华公司650-60 型分光光度计日本 HITACHI 公司-80℃冰箱日本 Sanyo 公司SW-CJ-1G 型单人净化工作台苏州净化设备有限公司Anke TGL-16C 台式离心机上海安亭科学仪器厂 YXQ.SG41.280 手提式压力蒸汽灭菌器