用聚合酶链式反应（PCR）进行丹顶鹤的性别鉴定课件.pptVIP

用聚合酶链式反应（PCR）进行丹顶鹤的性别鉴定 Sex Identification of Red-crowned Crane by the Polymerase Chain Reaction December 2004 Joumal of Northeast Agricultural University V01．11，No．2 151-155东北农业大学学报2004年12月刊 LI Jian-hong1，LI Shu-ling1,2，BAO Jun1，BAI Xiu-juan1(1．Life Science College，Northeast Agricultural University，Harbin Heilongjiang 150030，PRC；2．College of Animal Science，Northeast Forestry University，Harbin Heilongjiang 150030，PRC) 摘要 东方白鹤的性别决定基因引物被用于详述丹顶鹤W染色体的伴性基因——用PCR技术进行性别鉴定。7对成年丹顶鹤和15只年轻丹顶鹤的性别被鉴定出来。通过DNA序列分析，丹顶鹤和东方白鹤的相似性达94.77%。这项研究的结果显示PCR技术在丹顶鹤的性别鉴定中的应用是可行的。 关键词：丹顶鹤；性别决定基因；性别鉴定 据估计，约一半鸟类种族的基因性别不能通过成鸟个体的外观形态鉴定出来，对于幼鸟更困难。鸟类性别的鉴定从根本上是很重要的，不仅仅是因为濒临灭绝种族的繁殖，还因为基础性研究如分子生态学和发育生物学。 过去的几年，外科学和染色体检查都被用于鸟类性别鉴定，随着分子生物学和生物技术的发展，PCR技术的应用成为一种有效的途径。 在用PCR进行性别鉴定中，必须开发特定的性别标记，许多保守的与性别相关的基因已经被发现，它们能被用作标记来提供精确地性别鉴定。 性别相关基因在一些性基因上——只有来自雌性或雄性基因的上的一小段能够被放大，比如哺乳动物Y染色体上的SRY(Sex deter— mining region Y)gene嘲，ZFy(Zinc Finger，Y)gene问 and AMGY(Amelogenin，Y)gene[，雌性鸟类W染色体上的EEO．6同，CHDl一W(Chromo—Helicase—DNA binding—W gene[1‘81,A TPase W gene。用现在引物放大性别决定基因来进行性别鉴定在许多哺乳动物和鸟类中是可能的。 在这个研究中，与性别有关的东方白鹤的W染色体的基因引物被用于扩增丹顶鹤与性别有关的基因，以便探索一种新的用于在野生环境中鉴定这种鸟类性别的方法。 材料和方法 2.1Red-crowned crane and preparation of genomic DNA 丹顶鹤和基因组DNA 1、29只丹顶鹤，其中7对夫妇，15只未成熟的鹤，单独喂养 2、每只鹤的羽毛被收集和标记起来一进行个量分析 3、基因组DNA是用三氯苯酚从羽毛裂缝1cm部分提取出来的，包藏在零下20度 2.2Primers and PCR amplification 引物和PCR扩增仪 1、东方白鹤的性别决定基因引物（Forward 5’CACCCTGGATTGGACAACCTATITllC3and reverse 5 CACTCTITCCAGGAAATCAA3’） 2、从鸡禽Z/W染色体纺锤体蛋白基因序列上一段相同的序列A set of primers—CPEl5F(forward 5 7A AGCATAGAAACAATGTGGG AC3 7)／CPE1 5R fre． verse 5’AACTCTGTCTGGAAGGACTT3’1， 25uL混合物，包括： 2 mmol·LdNTP． 0.4 umol·L—each of primers 50 ng genomic DNA 1.0 U Taq polymerase(TAKARA)．and one—tenth volume of 10×PCR buffer． 扩增反应如下进行： 94℃下变性5min 94℃下35次循环变性80s 59℃退火90s 72℃延长60s 最后延长步骤在72℃下8min 最后在4℃保藏 8微升PCR产物复合物被2%琼脂凝胶分隔成100体积 用溴化乙锭染色 凝胶电泳分析系统分析 2.3Cloning and sequencing of PCR-amplified DNA fragment PCR扩增后DNA片段的克隆和测序 PCR产物被纯化后被转入JM109大肠杆菌中，然后质粒被提取出来。用双酶法来