凋亡研究进展及凋亡检测教学课件.ppt

细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术 细胞凋亡（apoptosis） 概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。 细胞凋亡的信号转导通路 死亡受体信号通路 线粒体信号通路 内质网和高尔基体的信号通路 细胞凋亡的基因调控 细胞凋亡诱导剂 化学诱导剂 H2O2 化疗药物 物理性因子 放射线 UV 生物因子 Anti-Fas TNF Trail 细胞凋亡的形态学变化 细胞凋亡的形态学检测方法 光学显微镜 荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI ) 电子显微镜 光学显微镜观察 荧光显微镜观察 电子显微镜观察 细胞凋亡的生物化学检测方法 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） TUNEL法 DNA片断化检测 DNA Ladder 测定 DNA含量分析 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 流式细胞仪分析（FACS） TUNEL法 检测原理： Tunel 原位凋亡检测试剂盒 检测方法 DNA片断化检测 DNA Ladder DNA含量分析碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一DNA低染细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰（sub-G1）即细胞凋亡群 细胞凋亡的分子水平检测方法 Caspase分子的检测 线粒体膜势能的检测 JC-1 凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 抑凋亡分子 相关信号通路分子的检测 Caspase分子的检测 Caspase3、8和9，2，6等 Caspase检测方法 分光光度法检测 FACS检测 Western Blot检测 全长检测 剪切体检测 Caspase 3 Western Blot检测 线粒体膜势能的检测(JC-1) 凋亡相关分子的检测 促凋亡分子 Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf-1和cytochrome c等 抑制凋亡分子 Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 端粒酶活性检测试剂盒 氧化应激系列检测 相关信号通路分子的检测 抗凋亡信号通路 PI3K-Akt pathway NIK-NF-kB pathway 促凋亡信号通路 MKK-JNK pathway Fas-FADD pathway P53 pathway 综合解决方案 Thank You! Zwzj@ 原理： JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。 线粒体膜势能（ JC-1 ）的检测 荧光显微镜检测 FACS检测 JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 检测结果： Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能 P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。 P53与细胞凋亡 IAP超家族的成员较多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成员在不断的被发现。IAP家族成员有一个共同的特征，含有一个或多个７０个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有环指装结构。BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-３和-７的泛素化降解作用。 IAP （Inhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子） Gene. 2007 May 1;392(1-2):187-95. Ap