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第一章绪论 基因（Gene）：又叫遗传因子，是控制生物性状的基本遗传单位，本质上是携带着遗传信息的DNA/RNA片段。 基因组（Genomic）：是指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA/RNA分子。 基因的类型： 结构基因、调控基因 断裂基因 假基因 移动基因 结构基因 结构基因和调控基因：能为多肽链编码的基因称为结构基因，包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白或激活蛋白的调节基因。有些基因只能转录而不能翻译，如tRNA基因和rRNA基因。还有些DNA区段，其本身并不进行转录，但对其邻近的结构基因的转录起控制作用，被称为启动基因和操纵基因。启动基因、操纵基因与其控制下的一系列结构基因组成一个功能单位叫做操纵子（operon）。就其功能而言，调节基因、操纵基因和启动基因都属于调控基因。这些基因的发现，大大拓宽了人们对基因功能及相互关系的认识。 断裂基因 20世纪70年代中期，法国生物化学家发现，细胞内的结构基因并非全部由编码序列组成，而是在编码序列中间插入无编码作用的碱基序列，这类基因被称为间隔或断裂基因。 重叠基因 1977年，首先发现了基因的重叠现象。1978年，费尔（Feir）和桑戈尔（Sangor）在研究分析φX174噬菌体的核苷酸序列时，也发现由5375个核苷酸组成的单链DNA所包含的10个基因中有几个基因具有不同程度的重叠，但是这些重叠的基因具有不同的读码框架。基因的重叠性使有限的DNA序列包含了更多的遗传信息，是生物对它的遗传物质经济而合理的利用。 假基因 1977年，在对非洲爪赡5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。由于假基因不工作或无效工作，故有人认为假基因，相当人的痕迹器官，或作为后补基因。 移动基因 1950年，美国遗传学家麦克林托卡在玉米染色体组中首先发现移动基因。她发现玉米染色体上有一种称为Ds的控制基因会改变位置，同时引起染色体断裂，使其离开或插入部位邻近的基因失活或恢复恬性，从而导致玉米籽粒性状改变。移动基因不仅能在个体的染色体组内移动，并能在个体间甚至种间移动。现已了解到真核细胞中普遍存在移动基因。基因移动性的发现不仅打破了遗传的DNA恒定论，而且对于认识肿瘤基因的形成和表达，以及生物演化中信息量的扩大等研究工作也将提供新的启示和线索。 DNA测序技术的起源 1975年 ，Sanger发明的DNA测序加减法为实现这一企图起了关键性的作用。 1977年， Maxam和Gilbert发明了化学降解法──由此而发展起来的大片段DNA顺序快速测定技术。 1977年，Sanger发明了末端脱氧终止法，已是核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段。 焦磷酸测序 (Pyrosequencing)技术 概念： Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 试剂：DNA聚合酶（DNA polymerase） ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase） 荧光素酶（luciferase） 三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin） 基本原理：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。 第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram?反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 第5步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 优点