基于DPO引物多重PCR在检测单增李斯特菌中应用.docVIP

基于DPO引物多重PCR在检测单增李斯特菌中应用 　　摘要：根据单增李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ和ｉａｐ基因设计了３对常规引物和ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物，采用多重ＰＣＲ的方法，建立了单增李斯特菌的快速检测体系，并比较了常规引物和ＤＰＯ引物的优劣，结果表明ＤＰＯ引物的特异性强，能够快速准确地检测单增李斯特菌。 　　关键词：单增李斯特菌；ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物；多重ＰＣＲ 　　中图分类号：Ｒ３７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3197-04 　　 　　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ DPO Primers 　　 　　ＬＩＵ Ｃｈｕｎ－ｚｈｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｌｏｎｇ２，ＪＩＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｕ１ 　　（１． Food and Bioengineering School Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ； 　　２． Ｈｅｎａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ） ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅs， ｈｌｙ， ｐｒｆＡ ａｎｄ ｉａｐ， ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）， ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ 3 pairs of ｒｅｇｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＰＯ primers ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ primers， could detect L. monocytogenes accurately and quickly． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ； ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ） ｐｒｉｍｅｒｓ； ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ 　　单核细胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，简称单增李斯特菌）是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患病致病菌，使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成孕妇流产、死胎等疾病，病死率很高。它能够耐受低ｐＨ、高盐环境，并且能在较宽温度范围内生长［１］。近年来，很多的突发病例都与消费的食品被单增李斯特菌污染有关。因此，快速、准确地检测单增李斯特菌对于预防这些疾病的发生至关重要。目前，ＰＣＲ技术被广泛应用于单增李斯特菌的检测。多重ＰＣＲ是在常规ＰＣＲ基础上改进并发展起来的一种新型ＰＣＲ扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的ＤＮＡ片段的方法［２］，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。多重ＰＣＲ虽为一种特异灵敏、简便快速、高通量的检测技术，但如果实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物［３］；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。 　　近年来，一种新兴的ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）技术，既可保证扩增的特异性，又可大大提高扩增效率，为多重ＰＣＲ技术的应用提供了新的前景［４］。本研究采用ＤＰＯ技术，建立了多重ＰＣＲ检测体系，以达到快速准确检测单增李斯特菌的目的。 　　１材料与方法 　　１．１材料与仪器 　　菌种：单增李斯特菌（ＧＩＭ１．２２８）购于广东省微生物菌种保藏中心；试剂：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购于北京百泰克生物技术有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购于宝生物工程有限公司；设备：梯度ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公司），凝胶成像系统（美国ＵＬＴＲＡ． ＬＵＭ．Ｉｎｃ）。 　　１．２引物的设计与合成 　　根据单增李斯特菌的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ、ｉａｐ基因的保守序列［５－７］分别设计３对常规引物以及相应的ＤＰＯ引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体如下（表１）。 　　１．３实验方法 　　１．３．１单增李斯特菌ＤＮＡ的提取Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取单增李斯特菌ＤＮＡ［８