重组门冬酰胺酶 设计性实验.pptVIP

* 重组门冬酰胺酶Ⅱ 表达 2011.12.9 制备 提纯 测定 原理 材料 方法 应用 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果分析与讨论 重组门冬酰胺酶Ⅱ应用 掌握 大肠杆菌发酵培养及重组蛋白的表达方法 掌握 重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备和提纯 酶活力和蛋白含量测定 纯度分析，计算收率 了解 重组门冬酰胺酶Ⅱ的应用 目的 原理 方法 应用 原理 1.Ansb的高效表达： 用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因（AnsB）两侧序列互补的寡核苷酸E1、E2, 作引物, 以大肠杆菌野生株CPU 210009的染色体为模板, 通过PCR扩增得到约1.2kb的DNA片段, 将此片段插入Pkk233-2的tac启动子下游, 转化不同的大肠杆菌宿主菌株, 结果表明以CPU 210009为宿主菌时, 转化子的酶表达量最高, 重组L-天门冬酰胺酶占菌体总蛋白48.3%, 发酵液酶活力达400IU/ml,比活为48IU/mg蛋白。SDS显示纯化后的重组L-天门冬酰胺酶分子量与天然酶相同, 均为140KD. 目的 原理 方法 应用 原理 1、提取 ①. 蔗糖溶液提取法： ②. 冷丙酮干燥破壁法： ③. 反复冻融法： ④. 超声破壁法： 2、纯化 离子交换层析： 亲和层析 3．L-ASP的修饰： 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP： 单甲氧基聚乙二醇(mPEG2)修饰的L-ASP： 目的 原理 方法 应用 1、提取 ①. 蔗糖溶液提取法： 向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40％，溶菌酶200mg/L，EDTA10mmol/L，pH7.5），在30°振荡2小时，8000r/min离心30分钟, 收集上清酶液。 ②. 冷丙酮干燥破壁法： 将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15min，5000r/min离心20min，收集沉淀，于室温下风干，研碎。向菌体干粉中入10倍体积0.01mol/L,pH8.0的硼酸缓冲液，于室温下搅拌30min，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。 ③. 反复冻融法： 将菌体在-30°和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓冲液（pH7.5）浸提30min，8000r/min离心回收上清酶液 ④. 超声破壁法： 1克湿菌体悬浮液在40毫升10mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液中，超声处理（输出300W，超声10秒，间隔30秒）10min。处理过程用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酸，4000r/min离心20min回收上清液。 大肠杆菌L-天门冬酰胺酶的提取，纯化和修饰 目的 原理 方法 应用 选择法1较为合适，提取收率最高。无抗癌活性的天门冬酰胺酶I存在于细胞质中，而有抗癌活性的天门冬酰胺酶II则分泌到细胞周质中。用蔗糖溶液抽提细胞，主要是提取位于细胞周质中酶。提取结束时，多数细胞并未发 生破裂，因此，提取液粘稠度不大，可以用8000r/min离心除去细胞。酶回收率与提取时间关系见下表： 目的 原理 方法 应用 2、纯化 1. 离子交换层析：①将CM - 52 凝胶装柱，酶液(用上述的蔗糖溶液提取液)以300ml/h上柱，穿出液测活以确保上样完全； ②以pH7.0 磷酸盐缓冲液洗涤凝胶,去除杂质，保持流速300ml/h； ③洗至柱床体积4～5 倍时，用紫外检测仪观察杂峰出现； ④杂峰出现后，收集并取样测活力，更换pH9.0 硼酸盐缓冲液洗脱； ⑤洗脱峰出现后收集酶液，记录体积并测活力，重复三次实验，收率见下表： 目的 原理 方法 应用 2. 亲和层析：①亲和介质装柱，以pH7.5磷酸盐缓冲液平衡柱子；②将离子交换层析洗脱下来的酶液上样吸附, 流速不宜过快，以免吸附不牢被洗脱下来；③上样完毕，测穿出液活力，确保吸附完全，用pH7.5磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白；④杂蛋白峰出现后，检测其活力，确保产物无流失；⑤以pH9.0甘氨酸缓冲液洗脱，收集并记录体积，取样测活，重复三次实验，收率见下表： 目的 原理 方法 应用 3．L-ASP的修饰： L-ASP来源于大肠杆菌，有较强的免疫原性，易在人体中产生针对L-ASP的抗体，引发临床上常见的进行性免疫反应和全身性过敏反应等副作用。另外，L-ASP制剂的抗肿瘤活性与其在体内的半衰期有关，天然的L-ASP在体内易被蛋白酶水解，半衰期短，治疗效果差[10]。 3.1. 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP： 利用PEG与L-ASP连接，从而改变这个酶的理化特性和生物学特性，进而减少它的过敏反应。Soares[11]等利用中等分子量的PEG对大肠杆菌的L-天冬酞胺酶进行修饰。研究结果表明，PEG-酶在PH3 .5 至pH 12.5的广泛范围内保持稳定，而且在酸性介质中的稳定性大大增加，在pH3.5时维持稳定