【毕业论文】BCA法测定蛋白质浓度.pptVIP

BCA法测定蛋白质浓度 06级临床七年二系三班 曹腾飞 目的： 学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的基本原理 熟悉分光光度计的使用 了解此法的优缺点 BCA法基本原理： 在碱性条件下，BCA与蛋白质结合，将Cu2+还原为Cu+ 详解： BCA（bicinchoninic,二辛可酸） 在碱性条件下，蛋白质与二价铜Cu离子2+络合并将其还原成一价铜离子Cu+ 一价铜离子和BCA试剂反应，颜色会发生变化：苹果绿→蓝紫色（复合物） 在562nm有强烈的光吸收，且吸光值与蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系。 根据A=BCL,A——吸光度，B——光吸收系数，C——蛋白质浓度，L——光程 器材与试剂： 器材：分光光度计；恒温水浴箱；枪式移液管；试管13支；吸管2ml一支 0.1ml三支 试剂：BCA工作液；蛋白质标准液；待测样品 实验内容： 操作 观察与记录 计算或处理 分析或结果 取试管13支，编号（除空白管只做1支外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作： 把实验数据记录于表格中 以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线 计算（两种） 标准曲线法 公式法计算 标准曲线法： 用测定管平均光吸收值在标准曲线上找出其相应的蛋白质含量，计算出待测血清中蛋白质含量（g/l） 公式法： 从标准管中选择一管与测定管吸收值相近者，按照比色法公式计算求出待测血清中蛋白质的浓度（ul） 结果与分析 准确的把结果以图表或数据形式清晰的表达 注意事项： 为定量实验，操作要准确 要注意实验试剂的准确应用，防止影响结果和避免浪费 实验应用： 特点： 1 操作简单，快捷，比经典的lowry法快四倍； 2 灵敏度高，最小检测量达0.5ug 3 准确，试剂稳定性好，在20ug/ml~2000ug/ml范围浓度内有良好的线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法 4 经济实用（待测样品体积可为1ul~20ul) 5 抗干扰能力强 LOWRY法（简介） 蛋白质在碱性条件下其肽键能与Cu2+螯合形成蛋白质—铜复合物，能使酚试剂中磷钼酸和磷钨酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质浓度成正比，故可在650nm进行比色测定 考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色由红棕色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质的定量测定 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 验目实的 实验原理 实验器材与试剂 实验内容 注意事项 实验应用 混匀，37°保温30min，比色测定 光吸收值 (λ=562nm) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 BCA工作（ml） 100 -- -- -- -- -- -- 待测样品 -- -- 20 40 60 80 100 双蒸水 -- 100 80 60 40 20 -- 蛋白质标准液（1.5mg/ml） *2 5*2 4*2 3*2 2*2 1*2 测定管 标准管 空白管 管号 试剂（ul）