第五章 转基因食品的检测和分析 转基因食品和 与安全课件.pptVIP

（二）RT－PCR RT-PCR 为反转录RCR或实时PCR共同的缩写，是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 二、翻译水平的检测 可以检测具有抗原性蛋白类表达产物的存在。 （一）免疫检测技术 1. Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白测定法。 从转基因植物中提取总蛋白质，经纯化处理后，进行SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子量大小分离，将凝胶上的蛋白质转移到膜上，按特定的程序与抗体杂交，对杂交结果进行检测便可得知被检植物组织内目的蛋白表达与否及其表达量。 Western杂交 加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗结合的带标记的二抗，最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶）的特异性反应进行检测。 抗体（Antibody，Ab）： 是高等动物体在抗原刺激下产生的一类 能与抗原特异结合的活性物质。 抗体具有双重性（它既是抗体又是抗原），即抗体又可以作为抗原。 一种抗体作为抗原刺激机体产生的新抗体叫抗抗体。 Western 杂交 提取待测样品蛋白质 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 蛋白质印迹（将蛋白质由凝胶转移至固相膜上） 制备探针 杂交与检出 2. ELISA法 （酶联免疫吸附法） 原理：将抗原或抗体用小分子的标记剂如荧光素、酶、放射性同位素等加以标记，借以提高其灵敏度的一类新技术。 ELISA是一种免疫测定。加入反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 优点：快速、方便、重复性好。 缺点：只能对某一特定蛋白进行检测。 间接免疫吸附测定法： 已知抗原吸附在微孔板内 加待检抗血清（含抗体） 加酶联抗抗体，与已吸附的抗原抗体复合物相结合 加入该酶底物 反应终止后依底物颜色深浅，可知样品中抗体的含量。 双抗体夹心法原理 酶标板（ 96孔聚苯乙烯微孔板） 酶联免疫吸附法（ELISA） 　双抗体夹心法 ： 　　 是测定待测样本中是否含有抗原的方法： 1） 将含已知抗体的抗血清吸附在微孔板上，形成固相抗体。 2） 加待测抗原，保温反应。形成固相抗原抗体复合物。 3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 样品中土霉素的ELISA检测 样品 1 2 3 4 5 CK OD 1.91 1.45 1.96 1.48 1.03 2.74 OTC量 0.056 0.457 0.021 0.109 2.952 （二）生物化学性质和生物学活性分析 通过定性和定量测定表达产物的生物化学性质和生物学活性，以鉴定表达产物的存在。 如: 酶活力测定，受体蛋白分析，激素活性的检测。 转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基因抗虫棉，右图为非转基因棉） 第五章 转基因食品的检测和分析 转基因食品的检测和分析：是指对深加工食品和食品原料种的转基因成分进行检测。 检测主要针对其中的DNA、蛋白质或脂肪酸等成分。 基于DNA的检测方法可分为两类： DNA杂交法：Southern、Northern、Western 基于PCR的检测方法 第一节 转基因阳性个体的分子鉴定 一、PCR技术 （一）标准PCR 1. 优点 快速、灵敏、费用低，检测仅需微量DNA，可同时检测多个样品。 PCR ◆聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 。 ◆ PCR反应包括三个步骤： ●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。 ●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃ ●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链 ◆