第三章 expression 酶工程和 与蛋白质工程 .pptVIP

第三章 重组蛋白的表达;一、 目标蛋白在大肠杆菌中的表达;1、表达载体的构建;;;;高特异性 只有T7RNA聚合酶才能使其启动 高效 T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右;;密码子的偏好性;在果蝇中，比起其它五种选择（每一种的出现频率约为13%）来说，更倾向于使用密码子CGC（33%）编码精氨酸。 在一些单细胞生物如E.coli、S.cerevisiae中，高表达的基因密码子的使用偏好性一般比较大。 这些偏好可能与两个原因有关：一是避免使用类似终止密码子的密码子；二是这些偏好能够有效地翻译密码子，因为这些密码子对应于生物体中非常丰富的tRNA。;;表达定位;BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。 (DE3)指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。 带有pLysS和pLysE的细胞产生溶菌酶，用于在诱导前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达。 ;;Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。;培养条件; 缺乏拼接机制 cDNA 缺乏翻译和加工 容易降解;二、目标蛋白在酵母细胞中的表达;AOX1启动子是目前最强有力和调控最严格的启动子之一 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合 外源蛋白表达量高，易于分离纯化 糖基化程度低，抗原性低 培养基成分简单廉价，菌株易于进行高密度发酵;1、表达菌株;2、表达载体;胞内表达 pPIC3，pPIC3K，pPICZA等 分泌表达 pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1等;;启动子;选择性标记; 外源蛋白自身的信号肽 酵母本身信号肽 α结合因子、酸性磷酸酶和蔗糖信号肽 ;单交换 外源基因插入His4或AOX1的上游或下游。整合率高，可重复发生 双交换 外源基因替换AOX1。整合率低，甲醇利用率低，表达效率高;Gene insertion;;;Gene replacement;3、外源基因在毕赤酵母中的表达;外源蛋白的表达方式;表达产物的翻译后加工、修饰; 外源基因的特性 整合位点和方式 基因剂量/拷贝数 产物稳定性 发酵条件;??源基因的特性;产物稳定性;发酵条件;三、 昆虫杆状病毒表达系统;1、杆状病毒表达系统的原理;重组蛋白具有完整的生物学功能：可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白 能进行翻译后的加工修饰：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致;表达水平高：最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％ 能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，约10Kb 能同时表达多个基因：既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因;;优点：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 缺点：表达水平低，获得高表达细胞株的时间长，细胞大规模培养的成本高。;病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用（脂质体法、电转化法、显微注射法）导人细胞内。;质粒载体 整合型载体：无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。 附加体型载体：在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。在复制中容易发生突变或重排。;2、表达载体的结构元件;常用：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞等 新型细胞株：来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK);4、表达系统;五、体外翻译系统;体外表达系统的优点 1，减少内源蛋白酶和内源性mRNA的干扰 2，合成含有非天然氨基酸的蛋白质或进行特异性标记 3，能直接以PCR产物为模板合成蛋白质 4，通过控制体外反应条件来控制蛋白质合成 5，可同时加入多种基因模板研究蛋白质相互作用; 兔网织红细胞系统