ibrv荧光定量pcr检测方法建立及其对单核巨噬细胞表达il2和ifnγ影响-establishment of ibrv fluorescence quantitative pcr detection method and its effect on expression of il 2 and ifn γ in monocyte macrophages.docx

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2018-05-29 发布于上海
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ibrv荧光定量pcr检测方法建立及其对单核巨噬细胞表达il2和ifnγ影响-establishment of ibrv fluorescence quantitative pcr detection method and its effect on expression of il 2 and ifn γ in monocyte macrophages

目录1引言11.1牛传染性鼻气管炎11.1.1牛传染性鼻气管炎病毒病原学1IBRV流行病学2IBRV的预防和控制31.1.4牛传染性鼻气管炎的诊断方法的研究进展51.2单核/巨噬细胞61.2.1单核/巨噬细胞的分化成熟及组织分布61.2.2巨噬细胞的生物学功能61.3细胞因子研究概况81.3.1细胞因子的特点81.3.2IL-2及IFN的功能91.4单核巨噬细胞与病毒感染的关系91.5研究目的与意义102检测IBRVgE基因常规PCR和荧光定量PCR方法的建立112.1材料方法112.1.1病毒和细胞112.1.2主要试剂112.1.3试验溶液112.1.4主要仪器122.2方法122.2.1MDBK细胞培养122.2.2病毒培养12TCID50测定13模板DNA的制备132.2.5常规PCR检测方法的建立132.2.6IBRV荧光定量PCR检测方法的建立142.2.7常规PCR与荧光定量PCR灵敏性、特异性检测142.2.8模拟临床样品检测142.3结果152.3.1病毒培养结果152.3.2TCID50测定结果152.3.3IBRV目的片段的PCR扩增及鉴定162.3.4常规PCR反应的特异性162.3.5荧光定量PCR反应的特异性172.3.6常规PCR反应的灵敏性172.3.7IBRV荧光定量PCR标准曲线建立及灵敏性检测182.3.8模拟临床样品的检测结果192.4讨论202.5小结213检测牛单核巨噬细胞表达IL-2与IFN-γ荧光定量PCR标准曲线的建立223.1材料223.1.1主要试验试剂223.1.2主要试验仪器223.1.3引物的设计合成223.2方法233.2.1PBMC的分离与单核巨噬细胞培养233.2.2单核巨噬细胞总RNA的提取233.2.3单核巨噬细胞总RNA的反转录24IL-2、IFN-γ及β-actin的鉴定25IL-2、IFN-γ及β-actin荧光定量PCR标准曲线的建立253.3结论与分析263.3.1单核巨噬细胞培养结果263.3.2IL-2、IFN-γ及β-actin的鉴定结果263.3.3荧光定量PCR方法标准曲线建立结果273.4讨论283.4.1本试验内参基因的确定283.4.2引物二聚体对实时荧光定量PCR的影响293.4.3荧光定量PCR结果分析方法的确定293.5小结304荧光定量PCR检测IBRV感染牛单核巨噬细胞后IL-2与IFN-Y的动态变化...314.1材料与方法314.1.1试验材料314.1.2试验方法314.2结果与分析324.2.1IL-2表达水平324.2.2IFN-γ表达水平334.3讨论344.4小结355结论36致谢37参考文献38附录43作者简介441.图1正常MDBK细胞（A）和出现CPE的MDBK细胞（B）152.图2IBRVgE基因的PCR扩增结果163.图3常规PCR反应特异性164.图4IBRVgE基因荧光定量PCR的特异性检测175.图5荧光定量PCR方法特异性溶解曲线176.图6常规PCR方法灵敏性检测187.图7IBRVgE基因荧光PCR标准曲线188.图8IBRVgE基因荧光定量PCR的灵敏性检测199.图9常规PCR方法检测模拟临床样品1910.图10荧光定量PCR方法检测模拟临床样品1911.图11牛单核巨噬细胞培养2612.图12IL-2、IFN-γ及β-actinPCR鉴定结果2613.图13实时荧光定量PCRIL-2标准曲线图2714.图14实时荧光定量PCRIFN-γ标准曲线图2715.图15实时荧光定量PCRβ-actin标准曲线图2816.图16IBRV感染牛PBMCIL-2的表达动态3117.图17IBRV感染牛PBMCIFN-γ的表达动态3218.表1单核/巨噬细胞的组织分布719.表2巨噬细胞的分泌产物及其功能820.表3TCID50测定和计算结果1521.表4应用于本试验引物序列及扩增产物大小2322.表5IBRV感染单核巨噬细胞后IL-2的表达水平3123.表6IBRV感染单核巨噬细胞后IFN-γ的表达水平33IBR（Infectiousbovinerhinotracheitis)牛传染性鼻气管炎IBRV(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus)牛传染性鼻气管炎病毒BHV（BovineHerpesvirus）牛疱疹病毒μL（Microliter）微升cDNA（complementaryDNA)互补DNAbp（Basepair)碱基对DNA（Deoxyribonucleicacid)脱氧核糖核酸CD（clusterofdifferentiation）分化决定簇h（Hour)小时IL（interleukin)白细胞介素IFN（interferon)干扰素MCP-1（Mo