hpd nlk调控nfkb通路和tgfβ通路及机制研究-study on hpd nlk regulating nfkb pathway and tgf β pathway and its mechanism.docx

个人简介 88致谢 89中文摘要本论文包括两部分内容，一是羟苯丙酮酸二加氧酶（hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPD）正调控 NF-κB 通路促进肺癌细胞存活和迁移。二是 NLK 通过 Smad4 抑制 TGFβ 信号通路活性。中国有句成语：物以类聚，人以群分。在生物学研究中也适用这样的准 则。功能相关的蛋白质通常以相互联系的方式调节复杂的生物学过程。因此， 蛋白质相互作用是发现未知蛋白功能或已知蛋白质新功能的重要手段。我们实 验室前期利用酵母双杂交技术平台构建了大规模的蛋白质相互作用网络，发现 了大量新的蛋白质间相互作用[1]。这个蛋白质相互作用网络为我们提供了很多 线索和提示。本课题选取该网络中发现的可能具有重要生物学意义的两对蛋白 质间相互作用—HPD 与 NEMO 和 NLK 与 Smad4 进行了深入研究。HPD 是酪氨酸分解代谢途径的关键酶[2]。NEMO 是 NF-κB 信号通路的核 心分子[3]。采用外源和内源免疫共沉淀实验我们验证了 HPD 与 NEMO 的相互 作用，确定 HPD 通过 N 端与 NEMO 的 N 端发生相互作用，并证明 HPD 可能 与 IKK 组成蛋白质复合体。过表达 HPD 加速 IκBα 的降解，促进 NF-κB 报告基 因活性，增加 TNFα 诱导的 NF-κB 靶基因 BCL-xL、cIAP2、ICAM-1、VCAM-1 的表达；利用 RNAi 敲低 HPD 表达则抑制 NF-κB 报告基因的活性；HPD 酶活 性突变不影响 HPD 调节 NF-κB 通路的作用，HPD 的催化底物-羟苯丙酮酸（HPP）和催化产物-尿黑酸（HGA）对 NF-κB 通路也无影响。这些结果说明 HPD 以不依赖酶活性的方式正调控 NF-κB 通路。机制上，我们发现过表达 HPD 可以增强 TNFα 刺激引起的 NEMO 泛素化修饰。利用 RT-PCR 技术检测 HPD 在小鼠各器官组织的表达，结果显示 HPD 仅在肝脏和肾脏表达，这与文 献报道一致[4]。有意义的是，检测多种细胞系中 HPD 的表达，发现除肝实质 细胞来源细胞系外，多株肺癌细胞中也表达 HPD。为进一步验证 HPD 在肺癌 组织中的表达及与 NF-κB 活性的关系，我们利用免疫组织化学技术检测了 HPD 及磷酸化 p65（S276）在肺癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况，发现 HPD 在肺癌组织中的表达强度和阳性细胞率都显著高于癌旁肺组织，并与磷酸化 p65（S276）的表达呈正相关。进一步，利用慢病毒介导的 RNAi 敲低肺癌细胞 A549 和 H1299 的 HPD 表达，结果发现 HPD 下调对肺癌细胞的细胞周期和增殖 没有明显影响，但克隆形成实验和 Transwell 实验结果显示，敲低 HPD 显著抑 制了肺癌细胞的克隆形成能力和迁移能力。综上，我们的实验结果发现 HPD 在 肺癌组织中异常表达，下调其表达可减低肺癌细胞的恶性表型，机制上可能与HPD 通过与 NEMO 的相互作用，以不依赖酶活性的方式激活 NF-κB 通路有关，提示 HPD 可能在肺癌的发生发展中起重要作用。NLK 是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，识别的保守序列为 S/TP 基序，通 过磷酸化底物的方式参与多种生物学过程[5-9]。采用免疫共沉淀和 GST pull down 我们证明 NLK 能与 Smad4 发生相互作用。进一步，我们初步实验的结果 发现 NLK 以不依赖激酶的方式负调控 TGFβ 信号通路，机制上可能与促进 Smad4 的泛素化修饰，降低 Smad4 的稳定性有关，但其生物学意义尚有待深入 研究。关键词： HPDNF-κB肺癌NLKTGFβStudy on the mechanism through which HPD regulate NF-κB pathway and NLK regulate TGFβ pathway(Abstract)This essay includes two parts, the first is hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPD) up-regulates NF-κB signaling pathway and promotes the survival and migra- tion of lung cancer cell, the second is NLK inhibits TGF-β signaling pathway by interacting with Smad4.It is said that birds of a feather flock together. The principle is al