番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞抗原表位筛选和应用.pptx

摘要：; 为了对MDPV YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 as)进行抗原表位作图，本研究设计了一套覆盖整个NSl蛋白的短肤，这些短肤长为30个氨基酸左右，有10个氨基酸重叠。为了表达这些短肽，共设计合成了31对互补的寡核营酸片段。上述寡核营酸片段退火后，插入至原核表达载体pET 32a中，经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。纯化蛋白经抗 His单克隆抗体鉴定。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测，Western blot结果表明，表达的融合蛋白NS ( 481-510), NS (501-530), NS (521-550), NS (541-570), NS (561-590), NS (581-610)和NS ( 601-627 )能被MDPV感染血清所识别，而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。综合上述试验结果，MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NSl蛋白的梭基末端481--627 aa。Dot-ELISA试验结果表明融合蛋白NS ( 501-530)???抗原性最强。; 以纯化的融合蛋白NS ( 501-530)为包被抗原建立了间接ELISA检测方法。确定了灭活疫苗免疫番鸭和自然感染番鸭的临界值为0.300。对240份阳性血清进行检测，阳性符合率为100%。对100份阴性血清进行检测，检测结果为：30份健康番鸭血清中有1份的检测值略高于临界值;70份灭活疫苗免疫血清中有1份的检测值略高于临界值，检测准确率为98.0%。本研究建立的ELISA检测方法与鸭瘟病毒(Duck plague virus , DPV )，鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus , DHV)和鸭呼肠孤病毒(duck reovirus, DRV)等阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明，该ELISA检测方法的敏感性优于中和实验。ELISA的板内及板间变异系数均小于10%，重复性较好。对含有抗原表位NS (5O1-530)的重组蛋白抗体消长规律分析表明，重组蛋白抗体在番鸭感染MDPV后第1周即可检测到，第3周达到最高峰，以后效价开始略有下降，一直可持续到第12周。上述实验结果可证明该ELISA检测方法可应用于MDPV灭活疫苗免疫番鸭和MDPV自然感染番鸭的鉴别诊断。; 本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA检测方法，为MDPV的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定提供了一定的技术支持。特别为将来使用灭活疫苗(或重组结构蛋白亚单位疫苗)免疫番鸭时鉴别自然感染番鸭与疫苗免疫番鸭奠定了一定的技术储备。;技术路线：;结果：;2. NS 1蛋白基因的分段表达;3 .重组蛋白的纯化;4 .重组蛋白的鉴定;5.重组蛋白的抗原性检测;上述31个重组蛋白都不与健康番鸭血清反应(图2-19, 2-20, 2-21)。;上述31个重组蛋白在Dot-ELISA中都不与健康番鸭血清反应(图2-25. 2-26, 2-27 )。;6 .NS 1蛋白抗原区481-627aa的分子特性分析;讨论：; 目前已有许多可供选用的技术上较为成熟的蛋白质抗原表位作图方法，如可通过诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合方法鉴定抗原表位，或通过研究抗原抗体复合物晶体结构来鉴定抗原表位，或分析庞大的随机肤链序列库等。竞争分析法是抗原表位作图中所采用的常用方法，该方法能够在较短时间内鉴定两种不同的单抗是否能够与同一蛋白质抗原结合。该方法非常通用且准确性极高。竞争分析法既可用于针对线性表位的抗体分析鉴定，也可用于针对构象表位的抗体分析鉴定。噬菌体呈现技术，既利用噬菌体呈现技术建立噬菌体随机肤库或噬菌体特异性肤库。现已有商品化的编码6.12. 15和20个氨基酸的噬菌体随机肤库。肤库是以菌种的形式储存的，并可以进行扩增。;增。这些小量分装的噬菌体可以表达多种独立的克隆。在与特异性的抗体混合后，通过生物淘选(biopanning)既免疫亲和筛选收集可以与抗体特异性结合的噬菌体，除去末被抗体结合的噬菌体。与抗体特异性结合的噬菌体经洗脱后，再去感染细菌，筛选下来的菌种再进行扩增。这样的多轮筛选过程一般需反复进行数次。筛选获得的单个噬菌斑一般采用基于特异抗体建立的ELISA方法进行检测。将DNA进行测序，分析DNA序列编码的肽链以确定抗原表位。噬菌体特异性肽库是指对已知可编码抗原肽段的基因，使用DNA酶进行部分消化，形成随机DNA片段，这些随机DNA片段是针对其开放阅读框的。然后将这些随机DNA片段以融合基因的形式与噬菌体的基因III相连，通过噬菌体表达含有目的抗原的开放阅读框蛋白片段的融合蛋白，而后针对