胶体金 幻灯片课件.pptVIP

3．间接法 为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图20-4)。 * 金免疫技术 金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术，于70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。 目前，金免疫技术除用于免疫组织化学染色外，还应用于金免疫测定中，由于金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛、简便、快速的检验方法。 金免疫技术方法学主要有金免疫组织化学染色技术和金免疫测定技术，前者包括金（银）免疫光镜染色技术和金免疫电镜染色技术；后者包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等。 第一节 胶体金与免疫金的制备 一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存 一、胶体金特性及其制备 1.胶体金的结构 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 2.胶体金性状 （1）胶体金一般性质：胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。 （2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，20～40nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小（如表20-1所示） 3.胶体金的制备 （1）制备原理 向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。 （2）操作要点 最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。 ①先配制HAuC14水溶液，加热至沸。②搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。③继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。④冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。通过改变柠檬酸三钠的用量可以制得不同大小的胶体金颗粒 4.胶体金鉴定 胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。 5.胶体金保存 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。 6.注意事项  （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 二、免疫金的制备 免疫金（immunogold）是指胶体金与抗原（抗体）的结合物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。 1.制备原理 胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团间靠静电力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合,同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条件。因此环境pH和离子