曾鹏光：“DNA和蛋白质技术”知识归纳及试题例析.docVIP

“DNA和蛋白质技术”知识归纳及试题例析 广东省揭东县登岗中学　　曾鹏光 一、知识归纳 1、DNA的粗提取与鉴定 （1）实验原理 ①血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有核DNA的溶液。 ②NaCl溶液：DNA在不同浓度的NaCl溶液的溶解度不同。当NaCl的质量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线如右图所示： ③酒精（体积分数为95％）：DNA不溶于酒精溶液，可是细胞中的多数物质可溶于酒精溶液，因而可进一步提取含杂质较少的DNA。 ④洗涤剂：能溶解细胞膜，有利于细胞内DNA的释放。 ⑤二苯胺试剂：DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以二苯胺可用作鉴定DNA存在的试剂。 （2）DNA的粗提取和鉴定 破碎细胞，释放DNA 加入20 mL蒸馏水，搅拌5 min，用1～2层纱布过滤备用 使细胞吸水胀破 溶解细胞核中的DNA 加入2 mol/L的氯化钠溶液40 mL，搅拌1 min DNA在高浓度氯化钠溶液中，溶解度最大 DNA的析出 加入蒸馏水约300 mL，不停地进行均匀搅拌，然后用3～4层纱布过滤混合液 降低氯化钠浓度，使DNA的溶解度降到最低 DNA的初步提纯 加入2 mol/L的氯化钠溶液20 mL，不停地搅拌，然后用2层纱布过滤混合液 DNA的再次提纯 加入95%冷酒精50 mL，然后进行搅拌 浓缩沉淀DNA DNA的鉴定 向两支试管中分别加入4 mL二苯胺试剂，然后将试管在沸水浴中加热5 min，比较试管中的颜色变化。注：二苯胺溶液要现用现配，否则会影响鉴定效果 沸水浴中DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 2、细胞内DNA复制与体外DNA扩增（PCR技术）的比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR 不同点 解旋 解旋酶，边解旋边复制 80～100℃高温解旋，双链完全分开 酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或RNA 能量 ATP 不加 温度 体内温和条件 高温（95℃→55℃→72℃） 子链合成 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 一般分为变性、复性、延伸三大步。分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃ 循环次数 受生物体自身控制 30多次 相同点 ①需要提供DNA复制的模板 ②四种脱氧核苷酸作原料 ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 ④都需在一定的缓冲溶液中进行 3、血红蛋白的提取和分离 （1）实验原理：依据蛋白质的各种特性可以将不同种类的蛋白质分离。 （2）常用方法 ①凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质。 ②电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同产生不同的迁移速度，由此将各种分子分离。 （3）蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 步骤 操作 样品处理 通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集到血红蛋白溶液 粗分离 通过透析法去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的杂质 纯化 通过凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质 4、凝胶色谱法与电泳法的比较 （1）凝胶色谱法 蛋白质的分离原理 根据需要被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 蛋白质分子运动情况 类型 相对分子质量大 相对分子质量小 大小 直径较大 直径较小 方向 垂直向下运动 无规则扩散 速度 较快 较慢 路径 较短 较长 洗脱次序 先流出 后流出 （2）电泳法 原理 利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 常用方法 琼脂糖凝胶电泳 由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中所带的电荷被掩盖，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 5、DNA和血红蛋白的提取和分离的实验流程比较 比较项目 DNA 血红蛋白 材料选取 鸡血细胞等DNA含量相对较高的生物组织 哺乳动物的成熟红细胞 细胞破碎 加洗涤剂和食盐搅拌、研磨 加蒸馏水和甲苯充分搅拌 去除杂质 ①用不同浓度的NaCl溶液处理 ②用酒精溶液处理 ③用胰蛋白酶处理 ①透析处理 ②纯化处理 鉴定方法 加入二苯胺试剂，并沸水浴加热 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 二、相关试题 1．下列关于DNA粗提取与鉴定实验的