无菌检查法 幻灯片课件.pptxVIP

2 无菌检查法（2010版） 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、生物制品、医药器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度10000下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对实验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 2 无菌检查法（2010版） 所用到的培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基 培养基的适用性检查： 无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基应符合无菌性检查和培养基灵敏度检查要求。本检查可在供试品无菌检查前或与供试品无菌检查同时进行。 培养基无菌性检查： 每批培养基随机抽取不少于10支（瓶），5支（瓶)置30～35℃，另5支（瓶）置20～25℃培养14天，均应无菌生长。 灵敏度检查： 菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。 2 无菌检查法（2010版） 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20～25℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成含菌数小于100 CFU/mL的菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏琼脂培养基上，23～28 ℃培养5～7天，加入3～5 mL无菌的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用灭菌的纱布将孢子悬液滤至无菌试管内，用无菌的0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成含孢子数小于100 CFU/mL的孢子悬液。 2 无菌检查法（2010版） 菌液稀释梯度的确定 用于灵敏度测定的菌液用相应的培养基进行计数，采用10倍梯度稀释法（1 mL+9 mL=10-1），每个扩增好的菌液稀释到10-7，用于计数的梯度为10-4～10-7，每个梯度用三个平行的培养基进行计数，取平均值作为菌落数。金黄色葡萄球菌、枯燥芽孢杆菌、铜绿假单胞菌用TSA平皿进行计数培养，30～35℃培养2天，生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基进行计数培养，30～35℃培养2天，白色念珠菌、黑曲霉用TSA平皿进行计数培养20～25℃培养3天。菌落数小于100 CFU的梯度下的菌液即为实验所需的菌悬液。 培养基接种 取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对照，置30～35 ℃培养3天；取每管装量为9 mL的改良马丁培养基5支，分别接种小于100 CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种，作为空白对照，置20～25 ℃培养5天。逐日观察结果。同时对相应梯度下的菌悬液进行计数复核，每种菌做三个平行，以确保培养基接种的是小于100 CFU的菌液。 2 无菌检查法（2010版） 结果判定：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基灵敏度检查符合规定。 供试品的无菌检查 抽验数量：系指一次实验所用最小包装容器的数量（支或瓶）。成品每亚批均应进行无菌检查。抽检量按下表： 供试品 批产量（N） 最少抽检数量 注 射 剂 N≤100 5个 100N≤500 10个 N500 20个 2 无菌检查法（2010版） 供试品接种及培养基接种 薄膜过滤法 采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm，根据供试品及其容剂的特性选择滤膜材质。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。 水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液和冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品溶液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗，每张滤膜每次冲洗量一般为100mL，总冲洗量不得超过1000mL，以避免滤膜上的微生物受损伤。 水溶液供试品：取规定量，每支（瓶）供试品装量为5mL及以下者，全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。 水溶液固体供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后按水溶液供试品项下的方法操作。 2 无菌检查法（2010版）