第6章 DNA重组的操作2.pptVIP

6.3 重组子的筛选 重组子的筛选（选择）： 经过各种方法将外源DNA分子导入受体， 获得所需目的重组子的过程 重组子：含有重组DNA分子的转化子 转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞。 重组子常见的筛选方法 抗药性筛选法 利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行筛选 插入失活筛选法 显色互补筛选法 IPTG＋X-Gal α-肽 营养缺陷型检测法 根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选阳性克隆。 载体分子携带有某种营养组分的基因，而宿主细胞不能合成此营养组分，因此将转化细胞涂布在此营养缺陷型培养基上，能够生长的就是转化子 2、PCR法鉴定 提取质粒 利用特异性引物，扩增目的序列 电泳，观察结果 质粒的提取 小量提取（碱裂解法，NaOH/SDS） 0.7%~0.8%琼脂糖凝胶电泳（检测所提取的质粒的纯度和完整性） 凝胶成像系统观察电泳结果 质粒的提取（碱裂解法，NaOH/SDS） 取1.5mL培养的克隆菌，12,000rpm离心1 min，加入预冷的100μL GET悬浮沉淀，涡漩，室温静置5 min； 加入200μL新鲜配制的NaOH/SDS碱裂解液，上下颠倒温和混匀，置冰上5 min； 加入150μL乙酸钾溶液中和，上下充分混匀，迅速置冰上5 min； 12,000 rpm离心5 min，吸取400μL上清液移入干净的离心管中； 加800μL 95％（100％）乙醇，室温放置3 min； 12,000 rpm离心5 min，用1mL 70％乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥约5 min； 沉淀用10-15mL TE（含10mg·L-1 RNase）溶解。-20℃保存备用。 《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002。 PCR鉴定 提取质粒，以之作为模板进行PCR，扩增目的序列 0.6~1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统观察电泳结果 3、酶切鉴定 提取的质粒为模板，双酶切，37℃水浴0.5~1h 1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统观察电泳结果 双酶切鉴定 4、杂交法鉴定 Southern blot：DNA水平 Northern blot：RNA水平 Western blot：蛋白质水平 5、测序 专业的公司进行测序 拼接（将测序结果拼接出完整的序列） 比对(alignment)，确定目的基因正确与否 一些序列分析软件，eg. DNA star，DNAMAN，DNAClub等 序列比对 / BLAST(Basic Local Alignments Search Tool) 最为常用的序列相似性比较的工具。 用于确定未知序列与数据库序列的最佳局部比对 根据序列和数据库中的序列不同类型分为5种 相似性比对结果分析 Bit分值：分值越高，比对越好 E值：序列比对的统计学显著性指标。E值越低，则比对就更有可能具有显著性。统计学上显著性并不一定表示生物学上的相关性。 从比对的结果，可以推测目的序列是否正确。 若序列已知，则只要利用软件将所测的序列拼接，并与已知序列比较，看是否完全相同 作业 4 1、什么是感受态细胞？大肠杆菌感受态细胞如何制备？ 2、简述常见的筛选重组子方法？ * * 6.1 受体细胞 6.2 重组体导入受体细胞 6.3 重组子的筛选与鉴定 第六章 DNA重组的操作 筛选与选择 筛选（screening）：进一步检测目的重组子 通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。 选择(selection)：转化子的初步筛选 通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。 选择与筛选并无必要严格区分 1 遗传表型直接筛选 抗药性筛选 插入失活筛选法 插入表达筛选法 显色互补筛选法 2 PCR法鉴定 3 酶切法鉴定 4 杂交法鉴定 Southern blot Northern blot Western blot 等 5 测序 1、遗传表型直接筛选法 根据载体选择标记初步筛选转化子 抗药性筛选 插入失活筛选法 插入表达筛选法 显色互补筛选法 将外源DNA片断插在BamHI位点 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 插入失活筛选法-过程 先将转化液涂布Ap平板 再将Ap平板上的转化子影印至含Ap和Tc平板 在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平板上不能生长的转化子即为重组子 插入表达筛选法 pTR262载体 Tcr CI Hind Ⅲ 外源基因未插入Hind Ⅲ 位点 CI基因阻遏蛋白抑制Tcr表达 质粒表型 Tcs 外源基因插入Hind Ⅲ 位点 CI基因失活 目的重组子表型 Tcr （LacZ’） 插入片段 （LacZ’失