合成绵羊抗菌肽nk-lysin的生物学功能及其对雏鸡沙门氏菌感染的治疗研究word格式论文.docxVIP

课题来源国家自然科学基金绵羊新抗微生物多肽基因的筛选、酵母表达及抗性分析项目编号：230960276新疆不同品种绵羊抗菌肽NK-Lysin多态性与抗肿瘤活性关系研究项目编号：1360589石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：2014年6月1日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。必威体育官网网址的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：2014年6月1日导师签名：时间：2014年6月1日中文摘要自然杀伤性细胞（NK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在机体免疫防御系统中与中性粒细胞、巨噬细胞一起发挥着至关重要的作用。抗菌肽NK-lysin存在于机体NK细胞和CTL细胞中，和人类的颗粒溶素（GNLY）是同源多肽，是天然免疫反应的主要组成部分，是连接适应性免疫反应和获得性免疫反应的纽带。近年来，抗生素药物的滥用使药物残留和细菌耐药性问题日益严重，严重威胁着畜牧业发展和人类健康，新型抗菌药物的研发成为迫切需要。抗菌肽成为新型抗菌药物研发的理想选择，在替代传统抗生素方面有着潜在的应用价值，具有广阔的市场前景。NK-Lysin的同源物颗粒溶素的研究已经进入临床阶段，而对NK-Lysin的功能和应用研究则较少。本研究探索绵羊NK-Lysin的原核表达方法，并分析其抗菌核心区域的结构和功能，通过化学合成绵羊抗菌肽NK-Lysin蛋白的主要功能多肽，检测合成多肽的抑菌谱和抑菌活性，利用雏鸡感染治疗模型验证绵羊抗菌肽对细菌感染的治疗作用，为绵羊抗菌肽NK-Lysin的功能研究和临床应用提供了科学资料。1、绵羊抗菌肽NK-Lysin的原核表达分析根据本实验室克隆的绵羊NK-Lysin基因GenBank（登录号为JX559777）序列设计引物，扩增绵羊NK-Lysin成熟肽基因（NK-Lysin-X）片段连接到pGEM-T载体，对重组载体进行酶切和测序验证，将验证正确的目的基因插入至原核表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性单菌落，重新摇菌活化，加入IPTG诱导表达。结果成功构建重组载体pET28a-NK-Lysin-X，pET30a-NK-Lysin-X，pET32a-NK-Lysin-X，pGEX-4T1-NK-Lysin-X，但NK-Lysin并没有在大肠杆菌中诱导表达，这可能与绵羊抗菌肽NK-Lysin的氨基酸组成和生物学功能相关。2、合成绵羊抗菌肽NK-Lysin的功能区多肽和生物学功能检测鉴于绵羊抗菌肽NK-Lysin在大肠杆菌中未能表达，本研究根据绵羊抗菌肽NK-Lysin的蛋白质二级结构预测及活性区域结构分析。利用生物信息学软件（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和/）分析、设计3段绵羊抗菌肽NK-Lysin核心区段，分别命名为NK7652-10、NK559777-18、NK7652-23，同时测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，通过MTT法测定其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果表明：合成多肽的长度、分子中α螺旋结构、Loop环状结构、分子内二硫键对多肽的活性是必不可少的；NK55977-18和NK7652-23均对大肠杆菌、沙门氏菌有明显的抑菌活性，NK-55977-18对金黄色葡萄球菌有微弱抑制作用，NK7652-10对三种菌均无明显抑制作用；NK559777-18、NK7652-23 对人肺腺癌细胞有明显的抑制作用。3、合成抗菌肽NK559777-18、NK7652-23 对雏鸡沙门氏菌感染的治疗研究为了验证合成绵羊NK-Lysin NK559777-18、NK7652-23 对雏鸡治疗的作用，建立雏鸡沙门氏菌感染模型并进行抗菌肽治疗实验。活化沙门氏菌后通过滴鼻、腹腔注射方式定量接种雏鸡，感染组随机分为A、B、C、D四组：A组不进行治疗，B组皮下注射多肽NK559777-18，C组皮下注射多肽NK7652-23，D组皮下注射氨苄西林钠，记录各组的临床症状和死亡情况，I剖检观察雏鸡内脏各器官病变及组织学变化，分析合成肽对雏鸡细菌感染的治疗效果。结果：A组在2h内全部死亡，B组在感染6h后的存活率为50%，C组存活率为100%，D组在感染6h后的存活率为0。说明多肽NK559777-1