atp7b突变基因转录水平研究及其突变蛋白三维结构分析word格式论文.docxVIP

全文小结……………………………………………………………………………………61参考文献……………………………………………………………………………………63 附录 …………………………………………………………………………………………68 攻读硕士研究生期间发表的论文………………………………………………………… 69综述………………………………………………………………………………………… 70中英文缩略词对照………………………………………………………………………… 78致谢………………………………………………………………………………………… 80ATP7B 突变基因转录水平分析及其突变蛋白三维结构研究研究生：刁胜朋 导师： 洪铭范教授摘要课题背景：肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration, HLD）又名Wilson 病（Wilson’s disease, WD），是由ATP7B基因突变所致的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病。世界范围发 病率为1/10万～1/3万，致病基因携带者约1/90；临床主要表现为血清铜蓝蛋白降低、肝 硬化、进行性加重的锥体外系症状、角膜K-F环（Kayser-Fleischer rings）及精神症状等。 目前，国内外已经发现大量APT7B基因突变位点，但是对这些突变转录水平及其突变蛋 白三维结构的研究仍然较少，而国内尚无相关报道。我们先前采用变性高效液相色谱法 对华南地区75例WD患者ATP7B基因突变筛查，共筛查出38种突变，其中有10种为国内 外首次报道的新突变。本研究采用常规PCR(Conventional Polymerase Chain Reaction)及 巢式PCR（Nested Polymerase Chain Reaction）对6个新发现的突变位点（2620GC、 2761AC、3446GA、3682AT、1875-1876insTTAA、3244-2AC）及4个中国人常见的突变位点（2333GT、2755CG 、3443TC、1543+1GT）进行ATP7B突变基因转录水 平研究。通过在线预测软件ProtParam、Protscale、Mensat3分析突变及野生型ATP7B蛋白 的理化性质、疏水性质、跨膜区结构。利用在线Swiss-Model软件进行野生型ATP7B核心 区域及其跨膜结构的同源建模，以此模板研究这些突变对ATP7B蛋白三维结构的影响。 目的：1．验证所发现的 ATP7B 突变基因是否从 DNA 转录到其 mRNA。2．研究 ATP7B 突变蛋白理化性质、疏水性质、跨膜螺旋结构。3．得到 ATP7B 蛋白核心区域及跨膜螺旋区三维结构；并以此为模板进行 ATP7B突变蛋白三维结构建模，分析突变对 ATP7B 蛋白结构功能的影响。4．对剪接位点突变：1543+1GT、3244-2AC 进行转录水平研究。5．分析 3244-2AC、2333GT 杂合突变与 2333GT 纯合突变患者基因型与表型的 关系，探索两个不同突变点的遗传学意义。方法：1．提取外周血淋巴细胞总 DNA 及总 RNA。2．采用常规 PCR 技术和巢式 RT-PCR 技术进行 WD 患者 ATP7B 突变基因（错义 突变、移码突变、剪接突变）转录水平研究，验证 ATP7B 突变是否从 DNA 转录到其 mRNA。3．通过在线蛋白质分析软件研究 ATP7B 突变蛋白理化性质、疏水性质、跨膜螺旋 结构。4．利用在线同源建模软件得到 ATP7B 蛋白核心区域及跨膜螺旋区三维结构；并利 用所建 ATP7B 蛋白三维结构模型进行 ATP7B 突变蛋白三维结构建模，分析突变对 ATP7B 蛋白结构功能的影响。5．使用巢式 RT-PCR 进行 1543+1GT 、3244-2AC 剪接位点突变异常转录研究。6．收集 3244-2AC、2333GT 杂合突变与 2333GT 纯合突变患者的临床资料、基 因检测结果，进行基因型与临床表型研究。结果：1．本研究验证了先前筛查工作中筛查出的 6 个新发现及 4 个常见突变位点。其中 7个错义突变 2333GT、2620GC、2761AC、2755CG 、3443TC、3446GA、3682AT，1 个插入突变 1875-1876insTTAA，2 个剪接位点突变 1543+1GT、3244-2AC。2．本研究证实 7 个错义突变中有 6 个错义突变（2333GT、2620GC、2761AC、3443TC、3446GA、3682AT）从 DNA 转录到 RNA 中；剪接位点 3244-2AC 在 mRNA水平存在异常转录；剪接位点突变 1543+1GT 未发现在 mRNA 水平有异常转录；插入 突变 1875-1876insTTAA 未发现