第二章 基因工程基本操作原理.pptVIP

第二章 基因操作主要技术原理 基因操作的主要技术 DNA重组的实验方法中包括 密度梯度 超速离心和电子显微镜技术 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 DNA序列结构分析 基因的人工合成 基因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法 第一节 核酸的凝胶电泳 用于分离、鉴定、纯化DNA分子以及蛋白质与 核酸相互作用的研究 琼脂糖(agarose)凝胶电泳 聚丙烯酰胺 (po1yacrylamide)凝胶电泳PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,PAGE 凝胶电泳原理 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比， 同分子的摩擦系数成反比的。 因此根据分子大小、构型或形状及所带的净电荷的不同，便可把各种成份分离开来。 凝胶电泳分离DNA片段 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团，呈离子化状态。DNA和RNA的多核苷酸链则称多聚阴离子(po1yanions)。 当核酸分子在电场中时，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 溴化乙锭核酸分子染色剂 溴化乙锭(ethidiumbromide，简称EtBr)是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光。 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后，在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA谱带， 溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中 琼脂糖凝胶 琼脂糖是一种线性多糖，从红色海藻琼脂中提取而来的良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。 化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。 LMP琼脂糖凝胶的优点 特性： LMP琼脂糖(熔点为62—65℃)一旦熔解，在37℃下持续保持液 体状态达数小时，在25℃下可持续保持液体状态约10分钟。 用途： 1) LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。 2) 一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37℃下，可直接进行一定的酶催反应。 在现代分子生物学研究及基因克隆实验中具有十分广泛的用途。 聚丙烯酰胺凝胶 过硫酸胺与TEMED(N、N、N`、N`-四甲基乙二胺)是单体丙烯酰胺的催化剂和诱变剂，它们使单体丙烯胺聚合成长链，长链与长链间就交联成凝胶，链长和交联成度决定了凝胶的孔径 DNA分子的酶切消化与凝胶电泳分离 凝胶分辨DNA片段的范围 由凝胶浓度所决定： 浓度高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 琼脂糖： 分辨DNA片段的范围为0．2—50kb之间。 如：2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而 对于较大片段的DNA，则要用低浓度(0.3％一1.0％)的琼脂糖凝胶。 聚丙烯酰胺： 分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。 如：20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达l一6bp DNA小片 段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酰胺的凝胶。 脉冲电场凝胶电泳 凝胶浓度的降低,孔径相应变大，但即便是浓度为 0.1％一0.2％的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子，况且这种情况的凝胶十分脆弱，极难操作。 大肠杆菌的染色体基因组DNA的长度超过4000kb， 因此，运用普通的凝胶电泳技术是无法分离超大分子量的DNA分子。 1984年，D．C．Schwartz和R．Cantor发明了脉冲电场凝胶电泳(pulsed—field gel electrophoresis，简称PFGE)技术，用来分离大分子量的DNA分子。 在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向是随着所用的电场方向的周期性变化而不断改变的。在标准的PFGE中，头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45o夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45o夹角。 脉冲电场凝胶电泳 第二节 核酸分子杂交 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术，1968年由华盛顿卡内基学院(Carnegie lnstitute of Washington)的 Roy Britten及其同事发明的。 原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，它们在一定的条件下，退火变