细胞培养技术与应用举例.pptVIP

方法与步骤 （1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法处死。背部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腰部两侧被毛。 （2）取肾及剪肾：在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用Hanks液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成1mm3大小的块，再并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。 （3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4 ～ 7.6），置37℃水浴中消化20 ～ 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出青霉素瓶，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。 （4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～50万个细胞为宜。 （5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，在培养瓶上做好标记，置于37℃的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。 二、传代细胞培养 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。 方法与步骤 （一）贴壁细胞传代培养 （1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。 （2）加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，37 ℃消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。 （3）用Hanks液洗涤1次，加入1～2滴管培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。 （二）悬液细胞的传代培养 （1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。 （2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1 000r/min）5min。 （3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。 1、悬浮培养 P209 1、动物细胞培养有哪三种类型？ 1、悬浮培养是用培养哪一类细胞的？ 2、悬浮培养有何优缺点？ 2、贴壁培养 贴壁指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养培养，主要用于非淋巴组织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。 在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。 在贴壁培养依赖性细胞中，请比较滚瓶培养系统和微载体培养系统？ 细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。图11-1为细胞在培养表面贴壁过程示意图。 3、固定化培养 固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。 由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。 常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。 细胞培养技术与应用举例 健康与运动科学系 体育保健与康复医学教研室 李庆雯 细胞培养的应用举例 4 细胞培养的常见问题 3 1 内容提要 细胞培养的原理 2 细胞培养的步骤 4 细胞培养的原理 细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，