第9章 原生质体杂交和体细胞杂交.pptVIP

原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 细胞融合就是两个不同物种的活细胞紧密接触在一起，使接触部位的细胞膜发生融化。这样，两个细胞的细胞质、细胞器互相交流，最后完全合并成一个细胞，通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，即原来两个细胞所属的物体的杂种后代，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。 植物体细胞杂交 用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。 植物体细胞杂交过程示意图 9.1 原生质体分离及纯化 一、原生质体分离 多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。 1、暗处理 2、预培养 3、预萎焉 4、预质壁分离 1、机械分离法（Machanical isolation） （2）酶液的配制 （3）分离原生质体 二、 原生质体纯化与活力测定 1、 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：离心。 第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。 1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 9.3 植物原生质体的融合 植物原生质体的融合技术 1、盐类融合法 1）硝酸盐类。NaNO3,KNO3,Ca(NO3)2; 2）氯化物类。NaCl，CaCl2，BaCl2等； 3）葡聚糖硫酸盐类。葡聚糖硫酸钾，葡聚糖硫酸钠等。 优点：对原生质体破坏小 缺点：异核体形成的频率不高。 2、高Ca2＋、高pH融合法 当钙离子达到0.05mol/L时，pH9.5~10.5时融合效果比较好 优点：融合效果好 缺点：高pH对原生质体产生危害 3、聚乙二醇融合法(PEG法） 加拿大华人高国楠提出。 优点：融合效率高，可重复性强，毒性底，形成双核异核体比例高。 4、PEG、高Ca2＋、高pH相结合的融合法 是目前认为最好的方法 5、电融合法 电融合法是将一定密度的原生质体悬浮液至于一个融合的小室中，小室两端装有电极。在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个电极间排列呈珠状。电脉冲可使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 杂种细胞的筛选 亲本细胞（A）和亲本细胞（B）进行植物原生质体融合后，含有五种细胞，分别是A，AA，AB，B，BB。 其中杂合细胞为AB，但是比例很少，占0.5~10%左右。 因此，必须要进行杂种细胞的筛选。 1 遗传互补法选择 1、营养缺陷型互补 硝酸还原酶缺失（NR-）筛选 亲本A（NR脱辅基酶缺失，nia型） 亲本B（钼辅助因子缺失，cnx型） 不能在非还原氮下生存。 杂合体AB因两种辅基都具有，因此能在非还原氮下生存。而A，B，AA，BB均缺失一个辅助因子而不能生存。 2、抗性互补法 亲本A抗5-甲基色氨酸 亲本B抗S-氨乙基半胱氨酸 杂合体抗5-甲基色氨酸和S-氨乙基半胱氨酸（双抗）。 可见标记法 1、凹穴皿分离法 2、微吸管分离法 4、 体细胞杂种的鉴定 1、杂种植物的形态学鉴定 2、杂种植物的细胞学鉴定 3、杂种植物的生化分析鉴定 葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株形成 实验步骤： (1)葡萄与柴胡原生质体融合 培养用葡萄品种“胜利”的花药接种在培养基上，诱导愈伤组织，继代后新长出的小颗粒状愈伤组织悬浮细胞系，用作融合受体。 狭叶柴胡幼茎茎节诱导并筛选出淡黄色粉粒状愈伤组织，继代培养建立悬浮细胞系，用作融合供体。 受体与供体以葡萄∶狭叶柴胡=1∶1的比例混合均匀，用PEG法诱导融合。 (2)杂种鉴定 。 (3)形态比较 细胞壁的再生 原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。 电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成