2005版《中国药典》细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test）法修订内容及背景.pptVIP

lb-04-12-24 2005版《中国药典》细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test）法修订内容及背景 李 波 中国药品生物制品检定所 2005.4.26青岛 细菌内毒素检查法相关理论及概念 细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查法 名词解释 细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxins Test） LAL (Limulus Amebocyte Lysate) Test TAL (Tachypleus Amebocyte Lysate) Test Limulus Test 细菌内毒素与热原的关系 细菌内毒素定义变化 过去一直认为，细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现革兰阴性菌之外的其它菌中发现内毒素或内毒素样分子结构， 如真核小球藻样绿藻。 所有内毒素均为脂多糖（LPS），但并非所有的脂多糖均为内毒素，因为其不具有相关的毒性。如：肽聚糖、葡聚糖 。 细菌内毒素标准品的建立 不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。 由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素标准品。 世界上现存鲎的种类 Limulus polyphemus Tachypleus tridentatus Tachypleus gigas Carcinoscorpius rotundicauda 3种 亚洲东海岸 1种 北美大西洋沿岸 鲎试验的发现 1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik. Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。 1963～1964年 Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。 多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制 鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 鲎试剂的种类： 依据鲎的种类分： 美洲鲎试剂（LAL） 中国鲎试剂（TAL） 圆尾鲎试剂（CAL） 依据检查方法分： 凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂 依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分： 普通鲎试剂和特异性鲎试剂 灵敏度 自身凝集 缓冲能力 水分 微生物检查 美国和中国鲎试验发展 1942年USP收载热原检查法 1968年Levin和Bang发表LAL实验 1973年FDA声明鲎试剂为生物制品，可用于药品生产的质控 1980年FDA宣布鲎试验法可用于药品成品检测，USP公布细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxin Test） 1953年 Ch.P收载热原检查法 ? ? 1977年广州药检所 1978-82年鲎试剂的早期研制阶段 美国和中国鲎试验发展历史 1983年规定了5种水和40种放射性药品的内毒素限值，同时删除了这些品种的热原实验。 1995年USP23，1-7增补本BET630种，热原检查仅40种 1983年11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立 1988年卫生部颁布（细菌内毒素检查法）和鲎试剂标准，试行两年 美国和中国BET发展历史 USP24版收载680多品种保留热原检查的药品不足30种 1991部颁标准规定了4个品种采用细菌内毒素检查方法，结果阳性时以家兔热原检查法判定。 1993年中国药典第二增补本开始收载该法 1995年附录收载了经修订的细菌内毒素检查法，正文收载了13个品种。 2000年收载69个品种，并收载了《细菌内毒素检查法应用指导原则》 细菌内毒素检查法的近年发展 2002年11月召开药典委员会生物检定专业委员会会议 2003年3月中检所药理室组织召开课题启动会议 2004年3月中检所药理室组织召开课题总结会议 2005版细菌内毒素检查法的修订。 改热原73品种，增订112品种。 国内鲎试剂的生产情况 安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂 细菌内毒素检查法方法的发展 凝胶法 比浊法：终点比浊法、动态比浊法 比色法：终点比色法、动态比色法 荧光偏振法 蛋白质染色法 同位素标记法 细胞因子测定法 国内细菌内毒素检查定量仪器的研究 93年天大无线电厂研制BET-32定量测定仪 细菌内毒素检查法的目的和前提 确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素。 一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。 细菌内