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实验六 用离子交换层技术纯化目的蛋白 【实验目的】 使学生掌握离子交换层技术纯化蛋白质的工作原理。学会筛选离子交换介质的工作方法，以及优化离子交换层析过程的策略，获得具有教高程度的蛋白质。 【实验原理】 离子交换层析技术是一种分离纯化生物物质的最常用的方法之一。由于此种方法是一种建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上的分离方法，所以它依赖于分离系统的PH高于被分离物质的PI时，被分离物质带负电荷，可被阴离子交换剂结合，相反，则同阳离子交换剂结合。生物分子表面所带电荷即使有很小的差别，也足以采用离子交换层析技术把它们分离开来。通过优化分离系统的离子强度和PH值以及采用梯度洗脱方法可以使离子交换层析的分辨力更高。 蛋白质是带有多个极性集团的大分子物质，在有多种蛋白质存在的蛋白质混合物溶液中，每种蛋白质因其分子大小，氨基酸组成的差别，对同一种离子交换介质具有不同的离子交换吸附能力，接着于此种差别，我们就可以在特定的离子交换层析技术环境下把目的蛋白分离出来。离子交换层析环境包括离子交换介质的种类、交联度、蛋白质溶液和离子交换层析柱平衡液的pH值及离子强度等。通过对离子交换层析环境的优化，可以使选择的离子交换剂在特定的环境下仅同目的蛋白结合。而不同其他蛋白结合，或者仅同杂蛋白结合而不同目的蛋白结合。然而，此种环境条件对大多数蛋白质来说是不易找到的。通常遇到的情况是，在特定的条件下，离子交换介质既能与目的蛋白结合也能与杂蛋白结合，但是对两者的结合量有所不同。在此种情况下，可以通过选用特异的洗脱条件选择性的将目的蛋白或杂蛋白从离子交换层析柱上洗脱下来，而达到分离纯化目的蛋白质的目的。 离子交换剂同其反离子的结合能力因反离子的种类不同而有差别。例如强酸性（阳）离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性（阴）离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-1的小；而弱酸性和弱碱性离子交换剂对上述离子的结合力的大小同强酸性和强碱性离子交换剂相反。因此在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因素。 蛋白质是两性离子物质，一种离子交换剂对它的结合力取决于蛋白质的理化性质和在环境中呈现的离子状态。当环境的pH值底于蛋白质的等电点（PI）时，蛋白质带正电荷能被阳离子交换剂吸附；相反，被阴离子交换剂吸附。在特定的pH环境中，PIpH，其值相差愈远，蛋白质的碱性愈强带正电荷愈多，愈易被阳离子交换剂吸附。 蛋白质是大分子物质，其溶液呈胶体状，因此用离子交换层析技术提纯蛋白质时，应选择那些选择性好弱酸性或弱碱性离子交换剂。并且希望其交联度小，孔隙大，以利于蛋白质分之渗透入交换剂的网孔中进行离子交换吸附。 蛋白质在离子交换剂上的吸附和解吸附（洗脱）受环境中的pH值和离子强度控制。因此，可以选择一种特定的环境条件促使蛋白质同离子交换剂吸附；选择另外一种环境条件（即改变pH或改变离子强度），使蛋白质从离子交换剂上解吸附，由于蛋白质的种类无记其数，组成各异，很难找到一种适用于所有蛋白质的离子交换层析条件（包括吸附和洗脱两种过程）。因此，每一种蛋白质的离子交换层析过程，都需要利用小样法对过程进行优化。常用的小样法是在试管中进行的而不是采用小型层析柱。通过改变离子浓度和pH值筛选最佳吸附和洗脱条件。 根据离子交换介质所带的反离子完全离子化的pH值范围，将其分类为强阳强阴，弱阳和弱阴四种类型。离子交换介质离子化范围较宽的为强，较窄的为弱，与反离子的结合强度无关。 在利用离子交换层析技术分离纯化某种蛋白质的时候，首先需要选择适宜的离子交换剂。对蛋白质而言，可以选用阴离子交换剂也可以使用阳离子交换剂究竟选用何种离子交换剂，要根据蛋白质的PI来决定。由于在研究工作开始时，人们尚不知道目的蛋白质的PI，所以一般先在生理pH值下对阴、阳两种离子交换剂都做小样实验。由于弱酸、弱碱性离子交换剂在生理pH值下的交换容量也比较高，用来分离蛋白质时，其生物活性不易受损，所以常被进行蛋白质纯化工作。Pharmacia生物工程公司新近研制出强阳SP型和强阴Q型离子交换介质的工作pH范围比弱阴DEAE和弱阳CM型的工作pH范围更宽，更易保持高交换量。所以不少研究工作者倾向于使用一些新型离子交换剂、代替弱阳和弱阴型交换介质。在基因工程药物生产实践中，常常根据产品分离纯化过程的不同阶段的样品性质和纯化目标来选择合适的离子交换介质。如下表所示： 产品纯化 阶段 样品性质/纯化目标 及工作原则 应选择的离子交换 介质（推荐） 捕获及产品粗分离 去除细胞碎片、快速浓缩、处理量越大越好，最短时间内捕获产品，避免产品被降解，减少核酸、内毒素对介质载量和UV检测的影响。介质须耐受高粘度、流速快，对分辨率的要求不高 Sepharose大颗粒（200μM）交换剂可在短时间里处理大量样品，阳