固定化酶的研究和进展.docVIP

固 定 化 酶 的 研 究 进 2008级 生物技术2班 摘 要：随着工业生物技术和酶工程的不断的发展，生产得到的酶越来越多。而酶的固定化技术也得到看广泛应用并得以迅速发展。除了传统的吸附法、包埋法、结合法、交联法及热处理法等，还涌现出很多新型的酶固定技术。 关键词：固定化酶 新型载体 无载体 固定化酶的研究始于20世纪50年代，1953年德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱思（Schleith）采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。20世纪60年代后期，酶的固定化技术迅速发展。传统的酶固定化方法大致可分为5类:吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。随着时间的推移，人们在传统的方法基础上不断推陈出新，相继发现了新的载体，如纳米载体【1】，也开始无载体固定化酶的研究【2】，还有酶的定向固定化及多酶共固技术的研究【3】等。 一、固定化酶的特性 采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程称为酶的固定化。固定在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 酶的化学本质是蛋白质,其催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差,易失活,并且反应后混入催化产物等物质,纯化困难,不能重复使用。固定化酶却有如下优点【4】，一是酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活性的影响，可以较长期的保持较高的酶活性；二是固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本；三是固定化酶易于和反应物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。但是固定化酶也有相当多的缺点,目前大都通过将酶固定在不溶性聚合物或无机载体上,形成的固定化酶在大分子底物转化中由于聚合物载体的存在而大大降低了酶的结合容量和反应能力,因此出现了以研究新型载体和无载体固定化酶的技术。 二、酶的固定化方法【4】 1.吸附法 吸附法是最早出现的酶固定化方法,包括物理吸附和离子交换吸附。利用各种固体吸附剂将酶或含酶载体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。采用吸附法制备固定化酶时，操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。但也由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定限制。 2.包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。使用的多孔载体主要有琼脂、琼脂糖、海藻硅酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。包埋法根据载体材料和方法不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后,借助引发剂进行聚合反应,通过物理作用将酶限定在载体的网格中,从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化,反应条件温和,因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失,常存在扩散限制等问题,催化反应受传质阻力的影响,不宜催化大分子底物的反应。 3.结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。结合法分为离子键结合法和共价键结合法。结合法所得的固定化酶与载体连接牢固,有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其它固定方法反应剧烈,固定化酶活性损失更加严重。 4.交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二醛、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。为此可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，取长补短。这种方法又称作双重固定化。 5.热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到固定化化菌体的方法称为热处理法。此法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。热处理法也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。 三、新型载体的研究进展 1.智能型高分子载体【5】 温度敏感、pH敏感、磁响应、离子响应等一系列由于外界环境变化而导致自身性质发生变化的高分子材料统称为智能型高分子材料。利用智能型高分子材料作固定化酶的载体,相对于传统载体,在保持酶活,提高酶负载量,改善操作稳定性等方面都有显著的提高。 几种重要的智能型高分子载体有：一是温度敏感型凝胶载体,即温度响应型高分子水凝胶,是一类可通过改变自身性质来对外界温度变化作出响应的智能