透射电镜标本制备的方法.pptVIP

透射电镜标本制备方法 薄片（〈1000埃） 1 制备硬标本块儿后超薄切片（最常规） 2 溶液成膜（颗粒〈1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子） 3 复型薄膜（在组织细胞表面或裂面喷上一层金属膜，将膜剥离后观察） * ξ1制备硬标本块后超薄切片 冰冻块切片： 简便，快，结构保存相对差，价格贵 树脂块切片 复杂，慢，结构保存较好，价格相对便宜 * 树脂块的制备 1 取材与固定 [目的] 将所取样本尽可能固定在生活状态下 * 固定剂 戊二醛（醛基和氨基反应） 四氧化锇（锇与双键螯合） 多聚甲醛（醛基和氨基反应） * 醛基和氨基反应 HC O + NH2 HC N （西佛碱） 醛醇反应 适合保存：蛋白质，核酸，多糖 不适合保存：脂类 分子量较小，渗透较快 * 固定效果：戊二醛优于甲醛 * 适合保存：脂类（蛋白质也可以） 不适合保存：核酸，多糖 分子量较大，渗透能力弱，均匀快速的固定局限于0.25mm(块〈0.5mm立方) 长时间固定组织块易脆 锇与双键反应 * 多用双固定：戊二醛+四氧化锇(两步或一步) 块不能太大〈1mm立方 * 固定液=固定剂+缓冲液 缓冲液：维持pH, 渗透压 0.1M磷酸缓冲液（PB） 固定剂浓度： 戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ） 四氧化锇(锇酸):1% （ 0.1M PB ） 多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ） 2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ） 1%戊二醛+1%四氧化锇（ 0.08M PB ） * 固定方法（迅速）： 原位固定 （一些不便于迅速摘取的组织） 灌流固定后取材（通过血液循环的途径将固定液引入到要固定的组织中，适用于离体后会变形变性的组织，例如肺泡，对缺氧比较敏感的脑组织等，注意选择最短的循环途径） 取材后固定 * [小]，[冷]， [快] 将动物麻醉或急性处死，暴露所需器官 剪取小块组织，放在预先冷却的固定液中 在洁净纸片上滴一滴冷却的固定液，取出组织块初步修块 （细长条：L：2-3mm,W：1mm） 转移回冷却的固定液中 * 常规（两步固定法） GA固定液中4°C 1~2h(中间0.5-1h可取出修块) 转移到冲洗液中（0.18M蔗糖in0.1MPB） 4°C 1~2h(原则上与固定时间相等)，中间换液2次 锇酸固定液中4°C或 R.T.1h dd水中冲洗 *在冲洗液中可存放1~2周，但每周至少换一次液（在固定液中长放易脆） *经GA固定后膜还有一定的渗透作用，在经锇酸固定后就没有了 *清洗要充分（GA与锇酸会产生微细沉淀，一般两个固定液间更换两次冲洗液后第三次过夜；锇酸与乙醇会产生微细沉淀） * 购买与存储 * 2 脱水 [目的]去除样品中的水，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备 脱水剂：乙醇或丙酮（梯度脱水） 50% 70% (80%) 90% 100% 100% 10-15m 10-15m 10-15m 10-15m 45m 45m 4°C 4°C 4°C 4°C或 R.T. R.T. R.T. * *低浓度时对组织有提取作用，时间不可长 *低温可降低提取作用，但100%低温会吸水 *可停在90%过夜，不能在100%，脆 时常摇动 *100%加干燥剂保存在干燥器中 * 3 浸透与包埋 [目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 * 包埋剂 （几类物质的混合物） 环氧树脂（基本成分） 氨类物质（催化剂） 酸酐（交联）固化剂 临苯二甲酸二丁酯（增塑剂） * 包埋原理 EPON 812 包埋剂的基本要求 * 脱水剂+包埋剂 1 ： 1 包埋剂 包埋剂 包埋剂 1h 过夜 12~48h 24h 37°C或 R.T. 37°C 45°C 60°C 胶囊中 胶囊中 胶囊中 *不要加盖 *R.T.下干燥器中可保存相当长时间 * 4 修块与切片 0.1*0.1mm 90度 梯形 * 玻璃刀（现做现用，20-30片） 钻石刀 切片机的工作原理： 金属膨胀杆 切片厚度与颜色 〈500A 600-900A 900-1500A 1500-1900A 1900-2400 2400-2800A 灰色 银灰色 金黄色 紫色 蓝色 绿色 *环氧 * 支持网与支持膜 铜网 不锈钢网 3mm 目数 镍网 金网 聚乙烯醇缩甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） 聚乙烯醇缩丁醛膜 火棉胶膜（1－4％in醋酸戊酯） 碳膜 *切片保存 *