第七章标记免疫技术.pptVIP

第九章标记免疫技术 标记免疫技术= 标记免疫技术 标记物: 常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I ①性质活泼、易制备标记物 ②对被标记物的免疫活性影响小 ③测量方法简便、已推广 ④半衰期较长、核素丰度高 标记方法 125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法 氯胺T法和乳过氧化物酶法 间接标记法 联接标记法 放射免疫分析（ RIA ） 基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。 以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F与Ag的量变存在着函数关系。 免疫放射分析（IRMA） 基本原理 单位点IRMA： 利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。 双位点IRMA 先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。 IRMA与RIA的异同点 标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。 反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。 反应原理 RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的直线关系。 特异性 在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。 检测范围 通常RIA的工作范围为2-3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。 分析误差 RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。 其他 RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在RIA中应用的为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。 放射免疫技术的应用 常用于各种激素、微量蛋白、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。 问题：放射性污染、常用核素半衰期短、试剂盒稳定期不长不易自动化仪器分析等。 第二节 免疫荧光技术 免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。 是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。 一 荧光的基本知识 异硫氰酸荧光素（FITC） 为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为389.4，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。 主要优点：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色，降低背景干扰 。 四乙基罗丹明（RB200） 为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。常用于双重标记或对比染色。 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对荧光有猝灭作用，因此荧光物质