酵母细胞基因组中与钙离子稳态相关基因的功能研究-生物分子工程专业论文.docx

目录第一章 文献综述1 1.1 酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径网络11.1.1酿酒酵母细胞中钙离子信号途径简介11.1.2钙调磷酸酯酶21.1.3 酵母钙调磷酸酯酶在应答环境压力中的作用41.3.3结论 181.4 本论文的研究内容及意义19第二章 材料与方法202.1 实验仪器与材料202.1.1实验所用仪器202.1.2主要实验试剂及试剂盒212.1.3主要溶液及配制方法222.1.4实验所用培养基252.2 所有实验的通用方法272.2.1菌株传代与保存272.2.2质粒或连接体系转化大肠杆菌感受态细胞272.2.3 碱裂解法快速提取质粒DNA 272.2.4PCR反应体系的建立和产物纯化272.2.5酶切反应体系的建立292.2.6连接反应体系的建立292.2.7酿酒酵母细胞的转化292.2.8酿酒酵母细胞的基因组DNA的提取302.2.9 细胞中总蛋白的提取312.2.10 Westernblot 312.2.11倍比稀释法进行表型实验312.2.12生物信息学方法31第三章酿酒酵母钙离子敏感菌株的文库筛选333.1 实验材料333.1.1实验菌株-缺失株文库333.1.2 实验中用到的引物343.2 本章实验方法353.2.1实验所涉及到的通用实验方法353.2.2 钙离子敏感菌株的文库筛选353.2.3 胞内钙离子含量测定363.3 实验结果363.3.1Ca2+敏感菌株的文库筛选结果363.3.2Ca2+敏感菌株的功能和定位分析413.3.3CsA对钙离子敏感菌株敏感性的抑制作用423.3.4胞内钙离子含量测定453.3.5MgCl2对钙离子敏感菌株的抑制作用493.4 本章小结与讨论51 第四章Class EVPS基因与钙离子信号转导的关系54 4.1 实验材料与方法544.1.1实验所用菌株、质粒和引物544.1.2实验所涉及到的通用实验方法564.1.3酿酒酵母细胞质内钙离子含量的测定564.1.4 酿酒酵母双基因缺失株的构建策略564.1.5酿酒酵母β-半乳糖苷酶活性的测定574.2 实验结果584.2.1Class EVPS基因的缺失导致胞内钙离子含量和细胞质内钙离子浓 度提高……………………………………………………………………584.2.2CsA抑制ESCRT缺失株对钙离子敏感性的作用机理研究594.2.3PMR1转录水平的降低导致ESCRT基因缺失株对钙离子敏感644.2.4PMR1的过表达可以抑制ESCRT缺失株对钙离子的敏感性674.3 本章小结68第五章 Nrg1负调控Pmr1695.1 实验材料和方法695.1.1实验所用菌株、引物和质粒695.1.2实验所涉及到的通用实验方法715.1.3EMSA实验原理和方法715.1.4GST-Nrg1融合蛋白的纯化725.1.5 染色质免疫共沉淀（ChIP）实验原理和方法725.2 实验结果745.2.1ESCRT缺失株中Rim101不能被正常剪切导致其对钙离子和锂离子 敏感 ……………………………..…………………………………..745.2.2ESCRT缺失株中NRG1表达量的升高导致PMR1表达量的降低.775.2.3Nrg1通过PMR1启动子上的两个结合位点对其进行负调控785.2.4Nrg1可以与PMR1启动子序列体内、体外结合815.3 本章小结83第六章 Crz1对PMR1正调控856.1 实验材料和方法856.1.1实验所用菌株、引物和质粒856.1.2实验所涉及到的通用实验方法866.1.3GST-Crz1的纯化866.2 实验结果876.2.1Crz1与PMR1启动子结合位点的鉴定876.2.2Crz1通过PMR1启动子上两个保守序列对其正调控886.3PMR1在碱性应答条件下的表达906.4PMR1，PMC1和7个ESCRT复合物以及NRG1和CRZ1遗传学相互作 用……………………………………………………………….…………..916.5 本章小结92第七章全文总结与展望937.1 主要工作总结937.2 相关工作的展望93参考文献(References)95发表论文和科研情况说明107致谢108第一章文献综述1.1 酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径网络在真核细胞中，钙离子（Ca2+）作为广泛存在的细胞内信使调控许多细胞过 程，如细胞增殖、肌肉收缩、细胞程序性死亡等[1-4]。酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中Ca2+信号传导途径已经被充分地研究，Ca2+信号应答涉及交配 信息素[5,6]、盐和环境压力[7,8]，营养物感应[9,10]以及细胞完整性[11]等方面。大量 研究显示酵母细胞中Ca2+稳态（homeostasis）和信号传导与高等真核细胞基本相 似（图1.1