生物化学 02第二章 核酸的结构与功能.pptVIP

概述 A H1N1病毒结构图 3-Helix Erwin Chargaff 碱 基 戊 糖 核苷酸的连接方式 DNA及其结构 一.概述 1.DNA的形状 2.DNA的碱基组成特点——Chargaff定律 （1）碱基当量定律：嘌呤碱总量=嘧啶碱 总量，即A+G=T+C A=T G=C (2)不对称比率A+T/G+C因物种（亲缘关系远近）而异 DNA的双螺旋结构 DNA的超螺旋结构 环状DNA形成的超螺旋 起始密码 四、核酸结构的稳定性 核酸结构稳定的因素： 1、碱基对间的氢键 2、碱基堆积力（是芳香 族碱基π电子间的相互作用引起的，当碱基堆积成有规律的结构时就形成了疏水核心，有利于互补碱基间形成氢键）对维持核酸的空间结构起主要作用。 3、离子键（环境中的正离子与磷酸基团结合，消除静电斥力，）对核酸结构有重要稳定作用。 DNA的变性过程及物化性质的改变 DNA的分子杂交 谢谢！！ 第四节 核酸的理化性质 一、核酸的主要理化性质 紫外吸收特性 （ 260 nm ） 变性、复性和杂交 小RNA中的核酶可催化核酸水解 按底物不同将其分为 DNA酶 和 RNA酶 两类 依据酶切部位可分为 内切酶 和 外切酶 限制性内切酶是DNA重组技术中重要的工具酶， 具有严格的序列依赖性。 主菜单 核酸的性质 一、一般理化性质 1、晶形 DNA为白色纤维状；RNA为白色粉末状 2、溶解性 溶于水；不溶于有机溶剂，70%乙醇中形成沉淀 3、粘度 DNA粘度很大 RNA粘度小 4、旋光性 强 5、密度及沉降性 RNA双链DNA； 环状DNA 开环、线状DNA 单链DNA 双链DNA 二.核酸的紫外吸收 纯DNA OD260/OD280=1.8 纯RNA OD260/OD280=2.0 核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30％－40％，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的 三.核酸的两性解离 核酸和核苷酸既有磷酸基又有碱性基团，是两性电解质，因磷酸的酸性强，通常表现为酸性 第四节 核酸的理化性质 二、变性 1、概念 核酸双链间氢键断裂，双链结构解开形成 两条单链的的过程 变性因素： 加热及化学处理（有机溶剂等） 2、特性 —— 伴有 高色（增色）效应 高色效应 在 260 nm 的紫外吸收增强 熔点（ Tm ） DNA 达到 50% 变性时的温度 DNA 分子中 G-C 组份愈多， Tm 值就愈高 DNA 分子就愈稳定；反之亦然。 主菜单 （ 图 示 ） （ 图 示 ） 二、DNA的变性(denaturation)是 双链解离为单链的过程 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链的互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，成为单链的现象。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260 粘度 比旋度 浮力密度 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素 pH（11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热 DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA(dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8 ＞1.8含有RNA污染 纯 RNA: A260/A280 = 2.0 ＜1.8含有蛋白质污染 ★ 紫外吸收性质- OD260的应用 紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度（Tm） Tm值：70～85?C，与G、C含量成正比 经验公式：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 2、热变性和Tm 3、核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程——复性 性质恢复，生物活性部分恢复，具有减色效应 变性的DNA缓慢冷却时可复性——“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 影响复性因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性/离子强度 加 温 返 回 主菜单 （ 变 性 ） 加 温 缓慢 降温 返 回 主菜单 （ 变 性 ） （ 复 性 ） 加 温 缓慢 降温 返 回 主菜单 （ 分 子 杂 交 ） 2