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T-cadherin在肝癌中表达及其对肿瘤侵袭潜能影响 　　【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)12－0259－01 　　【摘要】目的：探讨T-钙粘素（T-cadherin）在肝癌组织和细胞系中的表达及其对肿瘤侵袭潜能的影响。方法：30例肝细胞癌及其癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶和远处转移分为高侵袭和低侵袭2组并和同期15例良性肝病肝组织进行比较，分别采用RT-PCR和免疫组化技术等检测T-cadherin的表达水平。另选MHCC97L、MHCC7H和LM3共3株肝癌细胞系进行研究，检测T-cadherin的表达水平，同时应用RNA干扰沉默技术探讨其对侵袭潜能的影响。 　　结果：高侵袭肝癌T-cadherin的表达水平显著低于低侵袭肝癌（P ［1］。通过改进肝癌的早期诊断技术和外科手术方式对降低死亡率作出了重要的贡献。然而，即使是那些具有较好的临床和病理特点而进行手术切除或肝移植（OLT）治疗的患者，由于肝癌手术后的复发率很高，患者的生存能力仍然很差［2］。肝癌患者的预后较差，主要是受肿瘤原发病灶的侵袭转移所致。对肿瘤复发分子机制更好的认识，将更有效的治疗肝癌患者。此外，对能判定肝癌转移潜能和能预测肿瘤复发的特异分子标志物进行鉴定将有助于确定一部分肝癌患者，对他们来说，可通过OLT进行有效治疗甚至可治愈肝癌［3］。 钙粘素（cadherins）属于跨膜糖蛋白超家族，主要介导钙依赖性的同种细胞间黏附［4］。钙粘素水平的变化与癌症，特别是与其侵袭和转移相关［5］。T -钙粘素（T - cadherin），属于钙粘素超家族中的一种非典型GPI锚定的成员［6］。T -钙粘素基因表达水平的降低与肝癌的进展和预后相关性尚不清楚。本研究探讨T -钙粘素在肝癌组织和细胞系中的表达和分布及其对肿瘤侵袭潜能的影响。 　　材料与方法 　　1 组织和细胞:收集2005年1月至2010年12月在我院和苏州大学附属医院经病理学确诊为原发性肝细胞肝癌的手术切除的肝癌30例及其远离癌灶边缘2cm以上的癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶及远处转移等分为高侵袭和低侵袭2组，并与同期15例良性肝病肝组织进行比较。所取标本部分置于-80℃超低温冰箱中保存，另一部分作石蜡切片，所有诊断均经病理学诊断证??为肝细胞癌。另选3株肝癌细胞系MHCC97L、MHCC7H和LM3进行研究。 　　2 人肝癌细胞株 人肝癌细胞株MHCC97L、MHCC7H和LM3（三者遗传背景相同，侵袭能力依次增加）由苏州大学细胞生物学教研室惠赠。所有细胞株生长在添加10％胎牛血清，青霉素（100国际单位/毫升）和链霉素（100微克/毫升）的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基（DMEM培养液）中。 　　3 免疫组织化学：采用ABC法：组织标本进行4m厚连续切片，常规脱腊、水化，微波修复抗原，抗T-cadherin一抗用PBS以1：100稀释后4℃孵育过夜，二抗37℃孵育30min，ABC 37℃孵育30min，DAB显色，苏木素复染细胞核。PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断依据阳性细胞所占百分比进行评分，T-cadherin阳性细胞为细胞膜被染成棕黄色，100倍显微镜下任选10个视野，400倍镜下在每一个视野中连续计数100个癌细胞，记录其中阳性细胞数，取平均数后从0到4评分。0为10%的阳性细胞数，1为11%-30%的阳性细胞数，2为31%-50%的阳性细胞数，3为51%-70%的阳性细胞数，4为70%的阳性细胞数。 　　4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：用TRIzol分别从30例组织标本中提取总RNA，提取方法参照TRIzol试剂盒的说明书进行。用2g的RNA作为模板进行逆转录反应。PCR反应的引物序列按照文献所述［7］。循环过程包括：起始：94℃5min，变性：94℃30min，退火：50℃1min，延伸：72℃1min，共32个循环；最后72℃10min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳中验证。 　　5 Western blot 方法参照文献进行［8,9］。组织和细胞标本在Laemmli样品缓冲液中进行裂解，使用Bio - Rad公司的蛋白测定仪测定其蛋白浓度。还原条件下，在8％SDS -聚丙烯酰胺凝胶中电泳样品（每泳道80微克蛋白）。电转印将蛋白质转移到硝酸纤维膜（NC）上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液37℃下封闭NC膜60min，将兔抗人T-cadherin一抗和β-actin用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液以1：1000和1：200稀释后分别置入含有NC膜的杂交袋中4℃下孵育过夜，TBST缓冲液漂洗数次后，再以1：5000稀释的HRP标记羊抗兔二抗与其孵育