植物细胞悬浮培养相关技术.pptVIP

;目录; 1.单细胞的获得;1.1 由完整的植物器官分离单细胞;1.1.1机械法;具体方法:; 方法B：叶片研碎、离心; 研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol Tris—HCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。;例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法;1.1.2 酶解法;1.1.3 机械法和酶解法比较;1.2 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞;2.植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）;;2.1起始悬浮液的制备;2.2、悬浮培养的基本形式;2.2.1 分批培养（Batch culture）;2.2.1.1 分批培养的特点;2.2.1.2 继代的方法和最佳时期;;最佳继代时期： 选择指数生长期和直线生长期。;2.2.1.3细胞生长曲线;起始期 (lag phase);起始期 (lag phase);指数生长期 (exponential phase);对数生长期 (linear phase);减慢期 (progressive deceleration phase); 生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。;小结： （1）起始的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。 （2）加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。 （3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持指数生长期。 （4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。;操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2～4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。;2.2.2 连续培养（Continuous culture）;开放式和封闭式区别;连续培养意义： 1.植物细胞代谢调节的研究 2.某种生长限制因子对细胞生长的影响 3.次生产物的大量生产 紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg ;3 由悬浮细胞再生植株的途径;3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般也适用于建立该物种的悬浮培养。 ??活跃生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐的消耗很快，不久成为限制因子。要及时继代。 ;Noguchi等(1977)证明，把烟草悬浮培养物保存在一种含有标准的MS无机盐培养基中，培养开始3d之内无机磷酸盐的浓度就几乎下降为零，即使把培养基中磷酸盐的浓度提高到原来的水平的3倍，5d之内也会被细胞全部用完。 高等植物的悬浮培养，B5和ER培养基。 ;3.2 条件培养基;3.3 培养基的振荡的意义;4 悬浮培养细胞的同步化;4.1 物理方法;4.2 化学方法; 细胞周期（cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。 细胞分裂期：前期，中期，后期，末期 ;B 抑制法 使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、羟基尿和胸腺嘧啶脱氧核苷 当细胞受到化学药物抑制时，细胞周期只能进行到G1，细胞滞留在G1期S期的边界上。;5 悬浮培养中细胞生长量的计算;细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽滤，称重。 细胞干重：60℃干燥12h，称重。 以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。 ;6.培养细胞活力的测定;FDA法的原理;;思考题：;胡萝卜的悬浮培养;2.实验原理 在固体培养基中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，随着植物对营养物质的吸收，离愈伤组织越远，营养物质的含量逐渐增高。而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响。当植物的组织在液体培养基中生长时，可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 ;3.实验器材 主要实验用具和仪器：