小鼠IL-4Rα基因shRNA有效靶点的筛选.pptVIP

变应性鼻炎的治疗策略 治疗进展 转录后的抑制是变应性疾病的治疗热点。 反义RNA 和小干扰RNAs (siRNAs)是最为常用的方法. 小干扰RNAs的原理 小干扰RNAs的优势 siRNA 是双链结构, 更稳定; siRNA 不需要化学修饰; RNAi 技术不存RNase H 酶或立体结构抑制作用; RNAi 技术具有效应放大作用, IL-4Rα变应性疾病的重要作用 IL-4和IL-13酪氨酸激酶偶联受体信号通路（Jak-Stat途径）在IgE依赖的变应性反应中起着关键作用 IL-4Rα 是该通路的核心分子 目的 本研究探讨设计IL-4Rα的短发夹RNA（shRNA）序列，并合成IL-4Rα的RNA干扰载体，筛选有效shRNA干扰靶点。 实验步骤 目的基因RNA干扰载体制备 融合蛋白表达载体构建 RNA干扰有效靶点筛选 目的基因RNA干扰载体制备 shRNA载体的构建 PCR鉴定: PCR阳性克隆鉴定图片 正确克隆于表达载体的目的基因片段能够与EGFP融合表达 RNA干扰有效靶点筛选 采用荧光镜检检测目的基因不同的RNAi靶点干扰情况下的敲减效率 采用WesternBlot检测目的基因不同的RNA靶点干扰情况下的敲减效率 3# 靶点对外源表达的目的基因，对蛋白水平有最明显的knockdown作用，灰度分析显示，3# 靶点对Il4ra的knockdown效率大于90%，该靶点可以进入慢病毒的构建包装，用以完成后期的整体实验。 * * 小鼠IL-4Rα基因shRNA有效靶点的筛选 王 旻 北京大学人民医院 耳鼻喉科 避开致敏原——几乎不可能 药物治疗——部分患者疗效不肯定 副作用 免疫治疗——适应症窄 寻求一种有效的治疗方法可不容缓 Andrew Fire Craig Mello Nature 1998;391(6669):806-11 2006年诺贝尔医学奖获得者 RNA干扰是存在于真核细胞内 的一种自我保护现象，既能对 抗降解如病毒、自身异常基因 产生的mRNA。主要发生在基因转录后，即mRNA的修饰或翻译水平上，具有特异、高效和持久的特点。 TTCTCCGAACGTGTCACGT SD-NC AGAAGATGAGATAGTCAAA SD-3 AGGAGTTTGTGCAGGCAGT SD-2 GCCAGGAGTCAACCAAGTA SD-1 ???? Target Sequence Marker 酶切pGCsi载体以使其线性化 双链DNA oligo制备 克隆连接 转化 鉴定 挑选阳性克隆菌液送测序 融合蛋白表达载体构建（构建融合表达载体pEGFP-N1- Il4ra） 通过外源性靶点的筛选，所以首先要构建融合蛋白，即 包含有绿色荧光蛋白的载体同IL-4Rα的序列融合在一起 荧光镜检图片： PCl组为单转染过表达融合蛋白质粒的细胞组；NC为共转染阴性shRNA对照组；1# -3#为共转染不同靶点shRNA组； PC NC 1# 2# 3# 低浓度组 高浓度组