细胞表达量与蛋白磷酸化.doc

细胞表达量与蛋白磷酸化 1 材料1.1 样品 贴壁细胞株 1.2 实验试剂 1×PBS、培养基（培养液500ml（含10％胎牛血清）、青霉素、链霉素、胎牛血清、谷氨酰胺）、低浓度雌激素（1×10-10 mol）、高浓度雌激素（5×10-6 mol）、胰酶、BSA、聚丙烯酰胺凝胶、10×电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、PVDF膜、甲醇、0.4%台盼蓝、细胞裂解液、抗体等（雌激素的配制方法见附1） 1.3 仪器与设备 10mm培养皿（60个）、超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、培养瓶、 吸管、移液枪、枪头、废液缸、血球计数板、15ml离心管、96孔板等 2 实验方法 2.1 细胞蛋白表达量测定过程 SGC-7901细胞传代（27个培养皿） 培养至平板内细胞长势70%以下（一般为3天） 12h（9个培养皿） 24h（9个培养皿） 48h（9个培养皿） C H L C H L C H L 培养完成后提取细胞做Western 2.2 蛋白磷酸化实验过程 SGC-7901细胞传代（12个培养皿） 培养至平板内细胞长势90%以上（一般为4天） 5min（3个） 10min（3个） 20min（3个） 40min（3个） C H L C H L C H L C H L 培养完成后提取细胞做Western 对照：Control 高浓度处理：High concentration 低浓度处理：Low concentration 2.3 传代前准备 2.3.1 将已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热（20min），将实验所需要培养皿盒、枪头、15ml离心管、吸管、移液枪、废液缸等器械拿进超净工作台按照个人操作习惯摆放好。 2.3.2 用75％酒精喷洒超净工作台以及需要紫外灭菌的器械，打开紫外灯灭菌30min，注意紫外灭菌过程中不可打开风机。 2.3.3 灭菌结束后打开照明灯和风机，拿进预热好的培养液、PBS液和胰酶，喷洒75%酒精后放进超净工作台。 2.3.4 点燃酒精灯，注意火焰不能太小。灼烧剪刀、镊子和铁架台，撕开培养液、PBS液和胰酶的封口膜，在酒精灯外焰过火打开，用镊子从移液管盒取出移液管灼烧并根据实验者的习惯摆好。 2.3.5从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 2.4 胰蛋白酶消化 2.4.1 小心吸出旧培养液，用PBS清洗2遍，吸出PBS液后加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，喷上酒精放进37℃培养箱内消化1-2min。 2.4.2 消化结束后于倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 2.4.3 吸弃胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 2.5 吹打分散细胞与分装 2.5.1 用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液，将细胞悬液移入15ml离心管中，平衡后放入离心机中，以1000rpm离心3-5min。 2.5.2 吸弃上清液，加入8ml左右培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 2.5.3 使用血球计数板计数，得出每毫升细胞悬液中的细胞数。每个平板加入的细胞数目为10000-12000个之间，计算出加入培养皿细胞悬液体积。 2.5.4 使用移液枪吸取计算好的细胞悬液加入培养皿中，随后加入5ml培养液盖盖在超净台台面上轻微晃动，促使细胞均匀分布在培养皿底部，并做好标记。 2.5.5 未传代完的细胞悬液分装至2-3个培养瓶（每个培养瓶内加入5-8滴）中继续培养，做好标记加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.6 继续培养 2.6.1 用75%酒精喷洒培养皿和培养瓶，适当旋松培养瓶盖，一起放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2h后开始贴壁生长。 2.6.2 收拾超净工作台，将培养液、PBS液、移液管盒、培养皿盒等溶液与器械过火封口归还原位，移出废液缸，超净工作台各器械归还原位，喷上75%酒精擦拭干净，关灯与风机。 2.6.3 每天观察细胞生长状态，并记录成文字。 2.7 雌激素（E2）刺激 附1 17β-雌二醇（E2）的分子量为272.38D。雌二醇可溶于Dmso和无水乙醇。可将0.0027g的E2溶于1ml的无水乙醇配制成储存液，此时E2的浓度为10-2mol/L。再按需要的浓度依次稀释即可。 最好不要试图配制更大浓度的储存液，因为浓度再大溶解会困难。可以称取0.0272g的E2溶解于10ml