植物组织培养 第十一章 体细胞杂交.docxVIP

第十一章体细胞杂交教学目的与要求：在进一步认识原生质膜性质的基础上，深入了解细胞融合的基本原理，掌握电融合和PEG融合的基本方法。第一节、体细胞杂交的概念体细胞杂交，即原生质体融合。超性杂交对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合.第二节、原生质体的融合一、融合方法1．PEG诱导融合法PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。融合技术要点：融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmolKH2PO4 0.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH 10.5混合静止1min.2．电融合法与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。二、原生质体的融合过程三、影响原生质体融合的因素首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。其次，融合方法三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。第三节、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定一、杂种细胞的发育动态核质重组细胞器重组部分核物质或细胞器丢失核分裂的非同步性二、体细胞杂种的特点形态上的趋中性变异幅度大非整倍性双亲性状的共显性偏亲现象三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定1．杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择2．体细胞杂种的鉴定形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。二、体细胞杂种的遗传特性1．细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。2．基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。3．体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。第四节、体细胞杂种的应用一、体细胞杂种的应用潜力1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究二、体细胞杂交面临的困难1、融合特性的高效性2、杂种细胞的培养和选择3、杂种的遗传稳定性控制三、体细胞杂交研究的发展趋势1、诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研究2、电融合的程序化控制研究3、各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究4、杂种细胞培养技术的程序化研究思考题1．体细胞杂交的概念和类型。2．对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。3．PEG融合与电融合的原理及影响因素。4．杂种细胞的选择方法。5．如何用分子生物学方法鉴定杂种植株？