激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 课件.pptVIP

激光扫描共聚焦显微镜; 采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。;;Hippocampus neurons expressing GFP;;;;;LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较;;显微镜成像清晰度的决定因素:;1、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。;人眼及各类显微镜的分辨率;2、球差： 由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后， 不能聚焦成一点,使成像模糊不清,形成一弥散光斑(俗称模糊圈)，则此光学系统的成像误差称为球差。;3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。;LSCM的重要组件;;激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜;激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器;显微镜;物镜;LSCM物镜的重要参数 NA; 数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。 N.A=n*sin a/2 n：物体与物镜间媒质的折射率 a\2：物镜孔径角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。 N.A. 越大：放大倍数越大，分辨率越高， N.A. 越大：视场宽度与工作距离越小;;;载物台;计算机系统;图像分析与控制系统;????;激光共聚焦显微镜原理;图1. 共聚焦显微镜简化原理图 用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。;; 图2. 探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用） 只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。;;LSCM扫描图像方式;单一光学切片扫描 (single optical section, x-y);时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t);三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z);三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z);一种高分辨率的显微成像技术;4 用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。 5观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。;6 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。 7 动态观察在同一样