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Southern杂交 采用Roche 公司高辛标记试剂盒进行探针标记并进行Southern DNA分子杂交。 基因组 150~200 (g 10×限制酶缓冲液 50 (l 限制性内切酶 200 U 灭菌水 至总体积500 (l 混匀体系，37℃过夜酶切。 2)酶切产物电泳： 将酶切产物沉淀下来，并用50ul水溶解沉淀。制备0.8%琼脂糖凝胶，加5(l 10×loading buffer到50(l 的酶切消化产物中，上样并电泳，35V电泳过夜。 3.转膜 (1) 将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，置于0.25M HCl中浸泡10分钟； (2) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性，15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次； (3) 用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M Tris·Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和15分钟2次共30分钟，其间轻摇数次； (4) 剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于×SSC中至少5分钟，剪去一角与凝胶块对应凝胶上，赶除气泡； (5) 真空转移，20×SSC中性转移缓冲液真空转移1.5-2小时，压力5 inch Hg； 4.固定DNA： 用UV交联仪（UPVL1000）将DNA固定在膜上 5.探针的标记???探针可以提前制备好，冻存。根据Roce公司的DIG标记试剂盒进行如下操作：（所用PCR仪 Thermo Electron PxE基本型PCR仪） ??? 在25μl反应体系中加入2.5μl 10×PCR buffer（MBI），2.5μl 10×PCR DIG DNA labeling Mix（Roce），25pmol上游引物，25pmol下游引物，0.5μlTaq（MBI），50pg模板DNA，同时用未标记DIG的dNTP(MBI )作对照反应。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测标记效率，标记后的探针应比没有标记的产物分子量大，-20冻存备用。.杂交与检测（NBT/BCIP显色）：(1) 将固定好的尼龙膜放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，在杂交炉（Fisher分子杂交箱）中6保温4小时； (2) 弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针（2μl DIG探针/1ml杂交液），6杂交16小时； (3) 倒出杂交液，杂交液中含有未杂交的探针，放到-20度备用（4）用2×SSC，0.1% SDS溶液洗膜2×5分钟； ? (5) 用0.1×SSC，0.1% SDS溶液洗膜2×15分钟； ?（6）在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1~5min。 ?（7）20~30ml 封闭液孵育 30min； （8）．取anti-DIG-AP（Roce），按1:5000稀释于封闭液中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温孵育30分钟； ?（9）用20~30ml洗涤液洗涤2×15min； ?（10）15ml 检测液中平衡2~5min； ?（11）显色：现配20ml 显色底物（NBT/BCIP） 暗处静置显色； ?（12）50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存，将膜封存于装有TE的塑料袋中，可长期保存。 ????所涉及溶液的配制： 变性液?? 0.5mol/L? NaOH? 1.5 mol/L NaCl 中和液?? 0.5 mol/L Tris-HCl? 3 mol/L NaCl 漂洗液Washing Buffer（pH 7.5）： 0.1mol/L??? Maleic acid（马来酸） ???????? 0.15mol/L??? NaCl ???????? 0.3 %（v/v） Tween20 马来酸Buffer? Maleic acid Buffer（pH 7.5）： 0.1mol/L????? Maleic acid? ???????? 0.15mol/L???? NaCl 检测液Detection Buffer（pH 9.5）： 0.1mol/L????? Tris-Cl ???????? 0.1mol/L????? Nacl TE-buffer（pH 8.0）：??????? 10mmol/L???? Tris-Cl ???????? 1mmol/L????? EDTA 20×SSC（pH 7.0）：?????????? 3.0mol/