核酸的提取教学教案.ppt

RNA 2.消除Rnase的活性方法： （1）对于外源Rnase： 器皿和材料 塑料器皿（如离心管、Tip头、eppendorf管） 其它不能用高温烤的材料。 DEPC（焦碳酸二乙酯）： 0.1%DEPC水37℃浸泡2小时以上，并经高压灭菌； 碘乙酸水溶液 氯仿 RNA 玻璃器皿： 200℃干烤6-12 h 器皿和材料 RNA 加入DEPC至 0.1%浓度 然后剧烈振荡20min或室温过夜 ? 煮沸15min或高压灭菌以消除残余的DEPC 试 剂 ① 否则DEPC与腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 DEPC是Rnase的化学修饰剂，它与Rnase的活性基团组氨酸咪唑环反应而抑制Rnase的活性。 RNA （2）对于内源Rnase： 根据实验特点采用不同方法： 如体外转录等实验中加入Rnase的专一抑制剂(Rnasin)： 对于RNA的分离制备可采用非特异的蛋白变性剂、蛋白酶K、阴离子去污剂。 二、实验原理 细胞内RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。 制备RNA时，必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。 由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和苯酚法。 异硫氰酸胍/苯酚法（Trizol法）原理 裂解细胞：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； b. 沉淀Pro等杂质：有机溶剂抽提，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。 多糖如何去除？ 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用聚乙二醇或异丙醇代替乙醇沉淀DNA。 多酚如何去除 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 如何去除DNA？ 分离DNA与RNA：释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 在与组织/细胞匀浆后加氯仿分相时， 如果pH5.2，则DNA优先分配于有机相，水相则是RNA，组织蛋白以及部分核蛋白+大片段基因组变性以沉淀形式形成中间相。 若pH5.2，则DNA会部分分配在水相， Trizol的成分主要是异硫氰酸胍，β-巯基乙醇等RNase的抑制剂+十二烷基肌氨酸钠等表面活性剂+乙酸饱和酚和pH缓冲成分NaAc，整个试剂的pH在4~4.5之间 原理关键 在电场中，在中性pH值下，带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率与其分子大小、构型、电压、胶浓度有关。 OC构型 SC构型 L构型 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图 质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 1. 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 杂质： 　蛋白：加蛋白质变性剂（酚、氯仿）沉淀蛋白 　基因组DNA：碱变性+酸复性，分子量差异导致复性差异 　脂类及小分子杂质 　RNA ：pH和Rnase 三、提取质粒的原理 2.细菌裂解的方法： 碱裂解法0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求 3.碱裂解法 质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋闭合环状的特点。 碱变性条件下，染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开，双链不会完全分离。 pH调至中性，变性的质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。 染色体双链完全分开 质粒DNA为拓扑缠绕态不能分开 线状染色体DNA难复性 迅速准确配对，恢复天然超螺旋分子 染色体、变性蛋白质、RNA分子一起沉淀 上清中 SDS、加溶液II (氢氧化钠) 破坏碱基配对 加溶液Ⅲ (醋酸) 中和碱性NaOH 离心 染色体 试剂 质粒 4.煮沸法??? 染色体DNA比质粒DNA大得多。当加热时 ，染色体DNA发生变性呈长线状不易复性，质粒DNA虽也变性但在冷却时即恢复其天然构象。 变性长线状染色体DNA易与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分