2010版基因的表达、蛋白纯化教学教案.ppt

Expression，Purification and Antitumor Activities of Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis-Inducing Ligand（TRAIL） 原理应用 Sequence database genebank 表达载体 第一部分 可溶型TRAIL蛋白(sTRAIL)表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达和产物纯化 引物 P1：5’-GCGGATCCATGGCTATGATGGAGGTC-3’ P1’：5’- GCGGATCCGGTGATGACGATGACAAGACCTCTGAGGAAACCATT -3’ P2：5’-GCGAATTCTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’ BamHI EcoRI 肠激酶切割位点 1.TRAIL全基因及可溶型sTRAIL基因PCR扩增 提取正常人外周血淋巴细胞总RNA TRAIL全基因的获得 以该总RNA为模板，用宝生物公司的BeaBEST 反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物P1，P2进行第一次PCR。 sTRAIL基因的获得 以TRAIL全基因经纯化的PCR产物为模板，加入引物P1’，P2，再次PCR sTRAIL基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1. PCR amplification of extracellular region of TRAIL (sTRAIL) (560 bp ) with primer P1’ and P2; 2. PCR amplification of full length TRAIL gene (843bp) with primer P1 and P2; M. DNA molecular weight standard (DL-2000). TRAIL、sTRAIL基因PCR扩增结果 2.含肠激酶位点的pThioHisA-sTRAIL表达载体的构建 纯化后的TRAIL、sTRAIL PCR产物用BamHI、EcoRI双酶切。质粒pThioHisA用同样的酶双酶切，胶回收酶切片段，T4 DNA连接酶分别连接经双酶切的片段TRAIL、sTRAIL和质粒载体，转化宿主菌BL21，筛选阳性克隆。小提质粒，酶切鉴定重组子，并对重组子进行测序分析。 1. pThioHisA-TRAIL digested with BamHI and EcoRI (843bp+4329bp); 2. pThioHisA-sTRAIL digested with BamHI and EcoRI (560bp+4329bp); M. DNA Molecular weight standard (DL-2000). 3.重组质粒的酶切鉴定 pThioHisA-TRAIL序列分析 pThioHisA-sTRAIL在大肠杆菌BL21中的诱导表达，摸索诱导条件，3.0 mmol/L IPTG诱导6-8 h，表达达到高峰，经薄层扫描目的蛋白约占菌体总蛋白的39％左右。表达产物部分可溶，其余形成包涵体。融合表达产物SDS表观分子量为32000 Dalton左右（实际分子量为35608.21 Dalton）。 4.诱导表达 Location of Proteins in E. coli Sample Preparation 二、粗分 简单、易处理、快速。 如利用蛋白质溶解度不同，不同pH值，不同饱和度的硫酸铵沉淀；有机溶剂分级沉淀；分级离心等。 蛋白质的分离纯化的一般原则 三、精制备 离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲核层析、电泳、离心、结晶以及一些免疫的方法。 注意保持生物活性，如pH值、温度、加入酶的抑制剂、金属离子络合剂（EDTA）等。 蛋白质的分离纯化的一般原则 蛋白质的分离纯化技术 溶解度差别 分子大小不同 蛋白质分子带电性质不同 蛋白质吸附性质不同 蛋白质的特异性配体 利用溶解度差别的分离方法 　如：硫酸铵沉淀法 利用分子大小不同的分离纯化方法 透析 超过滤 离心 凝胶过滤（分子筛层析） Low speed High speed 差速离心（differential centrifugation） 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 密度梯度离心（density gradient centrifugation) ?A等速度沉降，B等密度沉降 凝胶过滤层析（Gel filtratio