2 基因工程操作的工具酶zx教学教案.ppt

　　可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA 杂交双链中的单链切口。 　　反应底物为黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。 　　反应系统中必须加有辅助因子ATP　　 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ 5′ 5′ (1) AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ (a)分子间连接 (b)分子内连接 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 (2) (1) (2) 噬菌体T4DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 大肠杆菌 DNA 连接酶 　　大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为75KD，对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。 DNA连接酶的主要功能： 就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 基因工程中不常用 　　大肠杆菌DNA连接酶，只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子。 　　反应系统中必须含NAD+作为辅助因子。 另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。 无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。 2.2.3 DNA连接酶的反应体系 T4DNA 连接酶的活性单位(Weiss)： 一个韦氏单位是指在37 ℃ ，20min 内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到γ，β-32P- ATP所需的酶量。 连接反应根据DNA片段的分子大小及末端结构，在12~30 ℃下反应1~16小时。 2.2.4 影响连接反应的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37 ℃ 连接粘性末端的最佳温度： 12～16 ℃ 平头末端的最佳温度： 10～20 ℃，温度过高会导致T4DNA 连接酶的不稳定。 2. T4DNA连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol~1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍） 大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow DNA 聚合酶 T４噬菌体DNA 聚合酶 T7噬菌体DNA 聚合酶 耐热DNA 聚合酶 2.3 DNA 聚合酶（DNA polymerase） DNA 聚合酶 是细胞复制DNA的重要作用酶。以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。 指在 DNA (或 RNA) 模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物 3’ –OH 末端聚合DNA 链的一类酶。 DNA 聚合酶在 DNA复制时起关键作用。 常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶； 大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶； T4DNA聚合酶； T7DNA聚合酶； 反转录酶等。 DNA 聚合酶主要有三类： 聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。 　其中聚合酶Ⅰ参与 DNA 修复，聚合酶Ⅲ参与 DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。 2.3.1 大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅰ和 Ⅲ 的比较 DNA 聚合酶的特点： ① 需模板 (DNA 或 RNA)； ② 需引物； ③ 具有三种酶活性，即 5 ′ →3′聚合酶活性；5 ′ →3′外切酶活性和 3 ′ →5′外切外切酶活性。 来源 　　　E.coli，由染色体 DNA