南方医科大学《生物化学与分子生物学》分光光度法.pptVIP

分光光度法 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 内容 分光光度法 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。 分光光度法的原理 Lambert定律 分光光度法的原理 Beer定律 分光光度法的原理 Lambert-Beer定律 分光光度法的原理 如何求被测组分的含量 1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度 利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU）， 利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 分光光度计的基本结构 常用的可见光分光光度计 V-1100D分光光度计 外观 V-1100D分光光度计 操作面板 V-1100D分光光度计操作步骤 开机，预热30分钟。 按 键切换到A档，转动波长旋钮，调所需波长。（见图1） 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖。 拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键A值校零。（见图2） 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A。 （见图3） 读数后，开盖取出比色杯。 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并晾干 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。 V-1100D分光光度计 使用注意事项 注意防震、防潮、防光和防腐蚀。 每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。 不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。 盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防溶液溢出。 比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。 注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。 测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心 2012春季学期 3 分光光度法的原理 1 如何求被测组分的含量 2 分光光度计的基本结构 分光光度计的使用与注意事项 4 3 I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层厚度 溶液浓度 I0 I 入射光强度 透过光强度 L C 液层厚度 溶液浓度 ＋ ＝ 如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。 标准曲线(浓度-吸光度曲线） 0.2 0.8 0.4 0.6 A 0 1 2 3 4 5 × × × × 根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 C 光源 单色 光器 吸收池 检测器 显示 钨丝灯可见光源350~1000nm 氢灯 氘灯 紫外光源 200~360nm 棱镜 衍射光栅 玻璃比色杯 石英比色杯 硒光电池 光电管 光电倍增管 玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区。 石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。 将光信号转变为电信号的装置。 记录装置：讯号处理和显示系统。 722光栅分光光度计 V-1100D分光光度计 1 — 样品室盖 2 — 样品架 3 — 拉杆 4 — 操作面板 5 — 波长旋钮 6 — USB接口 7 — 打印接口 8 — 散热孔罩 9 — 电源插座 10 — 电源开关 1 — 液晶显示器 2 — 按键 测量模式切换 确认/打印 数字加/校准零位 数字减/校准100%T 图1 图2 图3 大多数物质本身具有一定的颜色，也有一些物质本身虽是无色的，但加入适当的试剂后可生成有色的物质。溶液的浓度越大，其颜色越深，且对光的吸收也越大。所以，可通过测定比较溶液在某一波长下的吸光度值来确定溶液的浓度，这种方法叫比色分析法。比色分析法可分为光电比色法和分光光度法。 一束单色光在通过透明溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大，光线强度的减弱也越显著，即光吸收的量与溶液的厚度成比例关系。若以I0表示入射光强度，I表示透过光强度，L表示溶液的厚